峰高和峰面積測(cè)量?jī)H是對(duì)檢測(cè)信號(hào)的一種響應(yīng)該響應(yīng)需同組分的濃度或者質(zhì)量結(jié)合方可完成定量方法。無(wú)論在相同的還是不同的色譜條件下進(jìn)行的試驗(yàn),均要采取一定的手段加以校正,才可能得到準(zhǔn)確的定量結(jié)果。主成分自身對(duì)照法、峰面積歸化、內(nèi)標(biāo)法、外標(biāo)法及標(biāo)準(zhǔn)加入法是HPLC定量分析中常用的校正技術(shù)。

不加校正因子的主成分自身對(duì)照法是最簡(jiǎn)單的定量方法,也可以認(rèn)為是峰面積歸一化法的特殊形式,其使用前提是假定雜質(zhì)與主成分的響應(yīng)因子基本相同一般情況下,如雜質(zhì)與主成分的分子結(jié)構(gòu)相似,響應(yīng)因子將不會(huì)有太大差別。峰面積歸一化法簡(jiǎn)便快捷,但因各雜質(zhì)與主成分響應(yīng)因子不一定相同、雜質(zhì)量與主成分量不一定在同一線性范圍內(nèi)、儀器對(duì)微量雜質(zhì)和常量主成分的積分精度及準(zhǔn)確度不相同等因素,所以在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中采用有一定的局限性。

已知雜質(zhì)對(duì)主成分的相對(duì)響應(yīng)因子在0.9～1.1范圍內(nèi)時(shí),可以用主成分的自身對(duì)照法計(jì)算含量。超出0.9～1.1范圍時(shí),宜用雜質(zhì)對(duì)照品法計(jì)算含量,也可用加校正因子的主成分自身對(duì)照法。理想的定量方法為已知雜質(zhì)對(duì)照品法與未知雜質(zhì)不加校正因子的主成分自身對(duì)照法兩者的結(jié)合。研究人員可根據(jù)實(shí)際情況選用合適的定量方法。

1.歸一化法

對(duì)色譜圖中所有色譜峰進(jìn)行積分后得出總的峰面積,每個(gè)峰在總面積中所占的百分?jǐn)?shù)可視為歸一化峰面積。這種方法經(jīng)常被用作確定雜質(zhì)或次要組成在純物質(zhì)中的含量。

把所有出峰的組分(混合物中各組分)含量之和按100%計(jì),計(jì)算其中某一組分含量百分?jǐn)?shù)的定量方法,稱為歸一化法。此方法要求欲測(cè)樣品中各組分均能流出色譜柱,并在檢測(cè)器上都能獨(dú)立產(chǎn)生信號(hào),其中組分i的質(zhì)量分?jǐn)?shù)可按式(1)計(jì)算:

(1)

式中,A_i為組分i的峰面積;f_i為組分i的質(zhì)量校正因子。當(dāng)f_i為摩爾校正因子或體積校正因子時(shí),所得結(jié)果分別為組分i的摩爾百分含量或體積百分?jǐn)?shù)。

若樣品中的組分為同系物或同分異構(gòu)體,校正因子近似相等,可不用引入校正因子,將峰面積或峰高直接利用歸一化公式計(jì)算:

(2)

高效液相色譜中通常使用的檢測(cè)器均為紫外熒光檢測(cè)器等選擇性檢測(cè)器,它們對(duì)不同結(jié)構(gòu)化合物的響應(yīng)值差別較大,有時(shí)甚至可以相差幾個(gè)數(shù)量級(jí),對(duì)成分復(fù)雜的樣品分析而言,采用歸一化法定量顯然不可行。示差折光或蒸發(fā)光散射(ELS)檢測(cè)器等通用型檢測(cè)器對(duì)許多化合物有相似的響應(yīng),因此可以采用峰面積歸一化法定量。只含有UV響應(yīng)相似化合物的樣品也可以采用這種方法定量。實(shí)際上,在無(wú)法得到標(biāo)準(zhǔn)品的情況下,采用歸一化峰面積方法進(jìn)行定量分析相當(dāng)方便,盡管可能不很準(zhǔn)確。

歸一化法的優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確,進(jìn)樣量、流速、柱溫等條件的變化對(duì)定量結(jié)果的影響很小。歸一化法也存在諸多缺陷,首先校正因子的測(cè)定較為麻煩,雖然一些校正因子可以從文獻(xiàn)中查到或經(jīng)過(guò)理論計(jì)算求得,但要得到準(zhǔn)確的校正因子,還需要用每一組分的基準(zhǔn)物質(zhì)直接測(cè)定;再者必須所有組分都出峰,且重疊色譜峰影響峰面積的測(cè)量。因此方法的應(yīng)用受到一定程度的限制,在使用選擇性檢測(cè)器時(shí),一般不用該法。

2.外標(biāo)校正法

外標(biāo)法是以被測(cè)組分的純晶(或已知其含量的標(biāo)樣)作為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行對(duì)比定量的一種方法。取一定量標(biāo)準(zhǔn)品(即一定量已知濃度的溶液)在給定的色譜條件下注入色譜柱,并由測(cè)器測(cè)定其響應(yīng)值(峰面積或峰高)。在一定濃度范圍內(nèi),標(biāo)樣量與響應(yīng)值之間一般有比較好的正比例關(guān)系:

(3)

式中,A₀為峰面積;V₀為注入的標(biāo)樣溶液體積;C₀為標(biāo)樣溶液濃度;系數(shù)f₀可由實(shí)驗(yàn)測(cè)得。?

在完全相同的色譜條件下,如果未知樣品的進(jìn)樣量為V₁,實(shí)驗(yàn)測(cè)得的與標(biāo)樣相同組分的峰面積為A₁,根據(jù)式(3),由已知的A₀、V₀和c₀等即能求出樣品中該種組分的相對(duì)濃度c₁:?

(4)

對(duì)一種新樣品的高效液相色譜方法發(fā)展,或者儀器系統(tǒng)較為穩(wěn)定的常規(guī)分析,一般需要采用外標(biāo)作出校正曲線,并進(jìn)一步進(jìn)行定量校正。標(biāo)準(zhǔn)曲線法首先采用欲測(cè)組分的標(biāo)準(zhǔn)樣品繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線,如圖1所示。

圖1 外標(biāo)法校正曲線

用標(biāo)準(zhǔn)樣品配制成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)系列,在與分析欲測(cè)組分相同的色譜條件下,進(jìn)行等體積進(jìn)樣,作出峰面積對(duì)濃度的工作曲線。理論上,此標(biāo)準(zhǔn)工作曲線應(yīng)是通過(guò)原點(diǎn)的直線。若測(cè)定法方法存在系統(tǒng)誤差,標(biāo)準(zhǔn)工作曲線不通過(guò)原點(diǎn)。標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的斜率即為絕對(duì)校正因子。在圖1中,樣品1和樣品2對(duì)應(yīng)的濃度分別為1.5mg/ml和24mg/ml。從理論上講,截距為零的校正曲線只需一個(gè)標(biāo)樣即可確定,但在實(shí)際工作中一般使用兩個(gè)或更多個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度應(yīng)當(dāng)與未知樣濃度接近色譜法在線性范圍內(nèi)一般均能提供較好的響應(yīng)與濃度的線性關(guān)系。對(duì)濃度較大的樣品,作適當(dāng)稀釋,使之范圍落入線性范圍是一種很好的選擇。

在測(cè)定樣品中的組分含量時(shí),應(yīng)該在與繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線完全相同的色譜條件下,注射相同量或已知量的試樣進(jìn)行色譜分析,得到色譜圖,測(cè)量色譜峰的峰面積或峰高,根據(jù)校正曲線或響應(yīng)因子,結(jié)合式(3)和式(4)可以求出其濃度值。?

標(biāo)準(zhǔn)曲線法的優(yōu)點(diǎn)是:繪制好標(biāo)準(zhǔn)工作曲線后測(cè)定工作操作簡(jiǎn)單,計(jì)算方便,可直接從第標(biāo)準(zhǔn)工作曲線上讀出含量,特別適合于大批量樣品分析。

標(biāo)準(zhǔn)曲線法的缺點(diǎn)是:儀器和操作條件對(duì)分析結(jié)果的影響很大,要求分析組分與其他組篇分完全分離、色譜分析條件也必須嚴(yán)格一致;而且標(biāo)準(zhǔn)物的色譜純度要求高(或用準(zhǔn)確知道濃度的標(biāo)準(zhǔn)物,配置濃度時(shí)進(jìn)行折算);標(biāo)準(zhǔn)曲線法屬于絕對(duì)定量法,標(biāo)準(zhǔn)工作曲線繪制時(shí),一般使用欲測(cè)組分的標(biāo)準(zhǔn)樣品(或已知準(zhǔn)確含量的樣品),因此對(duì)樣品前處理過(guò)程中欲測(cè)組分的變化無(wú)法進(jìn)行補(bǔ)償。因?yàn)樵跇悠贩治鲞^(guò)程中,色譜條件(檢測(cè)器的響應(yīng)性能、柱溫度、流動(dòng)相流速及組成、進(jìn)樣量、柱效等)很難嚴(yán)格保證完全相同,因此容易出現(xiàn)較大誤差,故標(biāo)準(zhǔn)工作曲線使用一段時(shí)間后應(yīng)當(dāng)采用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及時(shí)進(jìn)行校正。

對(duì)不需要大量制備的樣品而言,外標(biāo)法非常有效外標(biāo)法由于方法操作和計(jì)算都比較簡(jiǎn)單,因此在液相色譜定量分析中經(jīng)常被采用。但是這種方法對(duì)操作條件的穩(wěn)定性要求較高,如檢測(cè)器靈敏度、流動(dòng)相流速組成等不能有太大變化。為了使溶液濃度保持恒定,要求標(biāo)樣及被測(cè)溶液被很好地密封,并且每次進(jìn)樣體積要有好的重復(fù)性,否則將會(huì)影響到定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。液相色譜自動(dòng)進(jìn)樣器的進(jìn)樣精度一般優(yōu)于0.5%,這對(duì)大多數(shù)分析來(lái)說(shuō)已足夠。如采用手工(注射器)操作,精密度要相對(duì)差一些,常需要配合其他校正技術(shù)。

外標(biāo)法是實(shí)驗(yàn)室最常用的定量方法,定量結(jié)果準(zhǔn)確,它具有如下特點(diǎn):不需所有的峰都流出或被檢測(cè)到,只對(duì)目標(biāo)組分作校正;需要標(biāo)準(zhǔn)樣品;進(jìn)樣量必須準(zhǔn)確;儀器必須有良好的穩(wěn)定性。

當(dāng)被測(cè)試樣中各組分濃度變化范圍不大時(shí),可不必繪制多點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線,而用單點(diǎn)校正法(比較法)。即配制一個(gè)和被測(cè)組分含量接近的標(biāo)準(zhǔn)溶液,定量進(jìn)樣,根據(jù)被測(cè)組分和外標(biāo)組分峰面積比或峰高比計(jì)算被測(cè)組分的含量。使用單點(diǎn)校正法需注意的是:當(dāng)方法存在較大的系統(tǒng)誤差時(shí),該法的誤差較大。

3.內(nèi)標(biāo)校正法

向樣品和校正溶液中加內(nèi)標(biāo)物是另一種校正技術(shù)。內(nèi)標(biāo)是不同于待測(cè)組分但能與待測(cè)組分完全分離的純物質(zhì),選擇的內(nèi)標(biāo)物還應(yīng)當(dāng)具有與待測(cè)組分相似的性質(zhì)。當(dāng)樣品中有幾種被測(cè)組分時(shí),要求內(nèi)標(biāo)物的保留值介于幾種組分之間,還需避免與其他組分峰重疊。

適宜的內(nèi)標(biāo)物需滿足以下要求:化學(xué)結(jié)構(gòu)與待測(cè)組分相似(同系物、異構(gòu)體);不存在于待測(cè)樣品中:不與樣品組分發(fā)生任何化學(xué)反應(yīng);保留值與待測(cè)組分相近;濃度(響應(yīng)值)與待測(cè)組分相當(dāng);與其他組分分離良好,但不能相距太遠(yuǎn);理化性質(zhì)與待測(cè)組分相似,有相似分離萃取性質(zhì)。內(nèi)標(biāo)法定量的具體操作步驟如下。

①先用分析天平準(zhǔn)確稱取被測(cè)組分a的標(biāo)樣W_a(g),再稱取內(nèi)標(biāo)物W_s(g),并加入一定量的溶劑將其溶解,如此得到的溶液作為混合標(biāo)樣使用。取一定體積混合標(biāo)樣注入色譜柱,得到的被測(cè)組分及內(nèi)標(biāo)物色譜峰的峰面積分別為A_a和A_s,相對(duì)響應(yīng)值為:

(5)

值得注意的是,式(5)中W_a、W_s分別是混合標(biāo)樣溶液中所含有的總的被測(cè)組分a及內(nèi)標(biāo)物的絕對(duì)質(zhì)量。內(nèi)標(biāo)法校正曲線如圖2所示。

圖2 內(nèi)標(biāo)法校正曲線

?②稱取含a組分的被測(cè)物W(g),另準(zhǔn)確稱取內(nèi)標(biāo)物Ws’(g),將兩者混合并用一定量溶劑配制成混合溶液。取一定體積混合樣品注入色譜柱,可得被測(cè)組分及內(nèi)標(biāo)物的色譜峰面積分別為為Aa’和As’,則被測(cè)樣品中目標(biāo)組分的響應(yīng)值:

(6)

(7)

組分a在被測(cè)樣品中的含量:

(8)

如果被測(cè)樣品中除a組分外,還有b、c、d等其他組分,均可按此方法,先分別求得每種組分的響應(yīng)值,然后再進(jìn)一步求得組分在樣品中的含量。與外標(biāo)校正類似,采用單點(diǎn)校正偏差較大,通常需要在不同濃度的樣品溶液中加入相同濃度的內(nèi)標(biāo)物配制成校正液,然后做出校正曲線。并進(jìn)一步確定樣品中的目標(biāo)組分含量。

內(nèi)標(biāo)法能夠補(bǔ)償由于儀器波動(dòng)造成的樣品體積或濃度的改變。使用內(nèi)標(biāo)的一個(gè)很重要的原因在于樣品有時(shí)需要繁雜的預(yù)處理或制備樣品處理包括反應(yīng)(衍生)、過(guò)濾、萃取等,這些步驟均會(huì)導(dǎo)致樣品的損失,而在樣品處理前加入合理選擇的內(nèi)標(biāo)物能夠校正這些損失。此外,內(nèi)標(biāo)法定量操作過(guò)程中將樣品和內(nèi)標(biāo)物混在一起注入色譜柱,進(jìn)樣體積的不重復(fù)對(duì)峰面積所造成的影響可以在計(jì)算過(guò)程中被抵消,因此只要混合溶液中被測(cè)組分與內(nèi)標(biāo)物量的比值恒定,溶劑體積的變化就不會(huì)影響定量結(jié)果。

要求內(nèi)標(biāo)物與樣品中所有組分均完全分離或許比較苛刻,對(duì)簡(jiǎn)單的混合物可能并不太難,但對(duì)復(fù)雜樣品來(lái)說(shuō)很難達(dá)到,此時(shí)使用內(nèi)標(biāo)物也許并不實(shí)際。內(nèi)標(biāo)法的精密度次于外標(biāo)法,因?yàn)閮?nèi)標(biāo)要求對(duì)兩個(gè)峰的結(jié)果同時(shí)加以測(cè)定,而外標(biāo)僅需一個(gè)峰。此外,選擇一種與其他峰無(wú)任何干擾的內(nèi)標(biāo)物也增加了方法的復(fù)雜性,因此內(nèi)標(biāo)法僅用在要求制備大量樣品方面,大多數(shù)常規(guī)分析采用外標(biāo)法或許更適宜。

內(nèi)標(biāo)法的優(yōu)點(diǎn):使用時(shí)沒(méi)有歸一化法的那些限制可以抵消色譜條件(如柱溫、載氣流速、橋電流和進(jìn)樣量)、進(jìn)樣量不夠準(zhǔn)確等原因帶來(lái)的定量分析誤差,特別是在樣品前處理(如濃縮、萃取、衍生化等)前加入內(nèi)標(biāo)物,然后再進(jìn)行前處理時(shí),可部分補(bǔ)償欲測(cè)組分在樣品前處理時(shí)的損失。內(nèi)標(biāo)法是以待測(cè)組分和內(nèi)標(biāo)物的峰高比或峰面積比求算試樣含量的方法。內(nèi)標(biāo)法可以分為校正曲線法、內(nèi)標(biāo)一點(diǎn)法(內(nèi)標(biāo)對(duì)比法)、內(nèi)標(biāo)二點(diǎn)法及校正因子法。

內(nèi)標(biāo)法的缺點(diǎn):選擇合適的內(nèi)標(biāo)物比較困難,內(nèi)標(biāo)物的稱量要準(zhǔn)確,操作復(fù)雜,且必須事先測(cè)得相對(duì)校正因子;同時(shí)加入內(nèi)標(biāo)物之后在分離條件上比原樣品要求更高一些(要求被測(cè)組分、內(nèi)標(biāo)物與其他組分都能分離)。

4.標(biāo)準(zhǔn)加入法

標(biāo)準(zhǔn)加入法也叫疊加比較法,是一種特殊的內(nèi)標(biāo)法。在選擇不到合適的內(nèi)標(biāo)物時(shí),以樣品中已有組分作內(nèi)標(biāo)物,將該組分純物質(zhì)加入到待測(cè)樣品中,然后在相同的色譜條件下,比較加入欲測(cè)組分純物質(zhì)前后欲測(cè)組分的峰面積(或峰高),從而計(jì)算出欲測(cè)組分在樣品中的含量。?

圖3 標(biāo)準(zhǔn)加入法定量

(a)未知樣品的色譜分離譜圖;(b)加入內(nèi)標(biāo)物后的色譜分離譜圖(此圖以組分2為內(nèi)標(biāo)物)

標(biāo)準(zhǔn)加入法測(cè)定多組分樣品時(shí),可選擇樣品中任一組分的純物質(zhì)作為內(nèi)標(biāo)物(選擇樣品中含量小的組分)進(jìn)行定量分析。具體步驟是:首先將樣品進(jìn)行色譜分析,得到色譜圖,然后同內(nèi)標(biāo)法,稱取樣品m(g),加入作為內(nèi)標(biāo)物的組分m_i(g),在相同的色譜操作條件下進(jìn)行試驗(yàn),得到對(duì)應(yīng)的色譜圖。由圖3中的兩張色譜圖可知原樣品中組分i(組分2)的色譜峰面積分別為A₂,原樣品中加入標(biāo)準(zhǔn)物后的色譜峰面積分別為A'₂,然后按內(nèi)標(biāo)法計(jì)算出組分i(組分2)的定量結(jié)果。根據(jù)圖3(a),有:

(9)?

同樣,由圖3(b),有:

(10)

結(jié)合式(9)和式(10),得到組分i的計(jì)算公式

(11)

式中,wi為樣品中組分i的含量,

標(biāo)準(zhǔn)加入法的特點(diǎn):進(jìn)樣量不必十分精確,操作簡(jiǎn)便,不需另外的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作內(nèi)標(biāo)物,且更利于色譜分離;在樣品前處理前加入已知量的內(nèi)標(biāo)物組分,可避免在前處理過(guò)程中欲測(cè)組分的損失對(duì)定量結(jié)果的影響。為保護(hù)結(jié)果的準(zhǔn)確性,要求兩次進(jìn)樣量必須完全相同,并要求兩次色譜條件完全相同以保證校正因子完全相等。

5.痕量組分定量分析方法

HPLC是分析各種類型樣品中痕量組分(≤0.01%)的一種有效技術(shù)。HPLC分析痕量組分的優(yōu)勢(shì)有:高分離能力,適合準(zhǔn)確定量;較好的靈敏度和選擇性;某些樣品的預(yù)處理簡(jiǎn)單;可以對(duì)原始樣品預(yù)富集以提高靈敏度。痕量分析的目的不同于混合物中主成分的定量檢測(cè),需要解決的問(wèn)題是測(cè)定混合物中一種或幾種組分的微量濃度。痕量分析的主要目的在于準(zhǔn)確求出痕量組分的濃度,由于本身低濃度的限制,通常只要求精密度在5%～15%范圍內(nèi)。

通常情況下,樣品無(wú)需預(yù)處理可以直接注入HPC柱中,然而有時(shí)痕量組分在分析之前必須經(jīng)過(guò)固相萃取、液液萃取、過(guò)濾、組合柱和柱后反沖等處理步驟,以使其濃度達(dá)到可以檢測(cè)的范圍,或去除一些可能影響分離、檢測(cè)的組分。樣品中經(jīng)常含有中性、堿性和酸性組分,以及疏水性較強(qiáng)的物質(zhì),樣品預(yù)處理能有選擇性地去除某些組分而保留所需組分此外樣品的預(yù)處理也可用來(lái)改善分析的準(zhǔn)確度。

為最大限度地消除干擾并得到最佳的準(zhǔn)確度痕量組分峰必須與鄰近峰完全分開(kāi)。兩峰靠得很近且痕量組分峰較主成分先流出時(shí),測(cè)量結(jié)果較精確。相反地,痕量組分峰在主成分峰拖尾的邊緣上洗脫時(shí),精確定量將很困難。

痕量分析通常采用等度洗脫的分離模式,這樣可以得到較好的檢測(cè)基線和保留時(shí)間重現(xiàn)性。痕量組分的定量分析常采用峰高定量法。這種方法受峰重疊影響較小(準(zhǔn)確度最好)且具有足夠的精密度。在痕量分析中為得到最好的靈敏度,一般盡可能加大進(jìn)樣量。假若樣品量有限,使用較小內(nèi)徑的色譜柱可以有效提高檢測(cè)靈敏度。

痕量分析外標(biāo)校正法:大多數(shù)痕量組分的校正均是在樣品基體(如血清)中進(jìn)行的。在空白(無(wú)分析物的基體)溶液中加入校正標(biāo)準(zhǔn)物,并進(jìn)行正常的樣品制備。校正范圍應(yīng)該包含樣品中待測(cè)物的濃度,且不應(yīng)與樣品中待測(cè)痕量組分濃度相差太多。在精心設(shè)計(jì)的痕量分析方法中,校正曲線應(yīng)該能外延至縱坐標(biāo)的零點(diǎn)。如果外延至零點(diǎn)以下,說(shuō)明在分離中已有部分樣品損失。如果校正線外延至零點(diǎn)以上,說(shuō)明基線干擾或樣品中的其他組分產(chǎn)生干擾。

在痕量分析中一般需要樣品的預(yù)處理過(guò)程(萃取、固相萃取等),為確保足夠的準(zhǔn)確度,對(duì)大多數(shù)系統(tǒng)分析物的絕對(duì)回收率至少為75%。當(dāng)回收率太低或不穩(wěn)定時(shí),適當(dāng)?shù)膬?nèi)標(biāo)能改善痕量分析的精度。假若空白樣品無(wú)法得到也可采用標(biāo)準(zhǔn)加入法。

標(biāo)準(zhǔn)加入法通過(guò)往樣品基體中加入不同質(zhì)量的待測(cè)物,并分別測(cè)出樣品的響應(yīng)值,用響應(yīng)值對(duì)加入的待測(cè)物濃度作圖,然后將直線外延至與橫坐標(biāo)相交所對(duì)應(yīng)的值即是樣品中待測(cè)物的濃度(圖4)。

?

圖4 標(biāo)準(zhǔn)加入法對(duì)廢水中痕量五氯苯(PCP)的定量分析?