WB免疫印跡法，也稱免疫轉移技術IBT(Immunoblotting)，是Towbin將1975年Southern發(fā)明的Soutnern blotting技術應用于蛋白-蛋白相互作用建立的免疫學檢測方法。其操作簡便，主要用于未知蛋白檢測及抗原組分、抗原決定簇鑒定，同時也用于未知抗體的檢測和單抗鑒定等，在生物學基礎研究和臨床疾病早期診斷和預后跟蹤分析方面都有應用。WB檢測的基本原理不做細述，可根據(jù)以下圖片腦補一下： 2017315161716345.jpg WB實驗中使用到的有三種抗體：一抗、二抗和內(nèi)參抗體。一抗是唯一針對目標抗原的抗體，可以進行制備也可以購買現(xiàn)貨，難度系數(shù)較高；二抗直接買就OK，只是需要留意下種屬選擇；內(nèi)參抗體必不可少，是WB實驗中的質控環(huán)節(jié)。 那么，寶寶們在制備抗體或者選擇抗體時，是不是十分糾結？今天，小編跟大家聊聊。 WB檢測之一抗 一抗制備 如果目的蛋白的現(xiàn)貨抗體沒有找到，或者都不中意，就需要親自動手制備了，請公司幫你做也不錯哦！自己制備一抗通常情況下可以選小鼠、兔制備多抗或者選小鼠制備單抗，前者省時省錢，后者耗時耗財卻各有優(yōu)缺點。多抗制備出來容易產(chǎn)生雜帶，卻容易出結果，單抗制備出來能得到單一條帶及一張漂亮的WB圖片，拿去炫耀下也不錯。然而做單抗如果沒有強有力的細胞培養(yǎng)、融合、篩選經(jīng)驗，也有各種意想不到的結果。比如完敗，或者只篩到一株卻不能做WB。不過在每一步實驗中注意細節(jié)還是可以得到滿意的抗體的。 多抗制備過程： 第一步：免疫及效價檢測?？此浦皇前芽乖蜻M動物體內(nèi)，其實暗藏玄機，不同的免疫方式效果不一。通常情況下，免疫效果排序如下：皮內(nèi)>皮下>腹腔>靜脈，通常采用皮內(nèi)或皮下免疫。免疫劑量過多過少均會產(chǎn)生免疫耐受，一般小鼠每次每只免疫50 μg共4次，兔每次每只免疫300-500 μg共5次。每次免疫后測定效價均要設置對照，以排除各種情況導致的ELISA假陽性或假陰性。 第二步：取血。小鼠取血通常采用眼球取血，一只小鼠可得到大約1.5 mL的抗血清。兔取血通常采用頸動脈取血，一只兔可得到大約25 mL的抗血清。 第三步：抗體純化。單抗的純化使用proteinA/G即可，得到的都是均一性的抗體分子。多抗的純化可以采用proteinA/G或抗原親和純化，后者篩掉了一些非特異性的IgG，留下的都是能與抗原結合的抗體，所以能在一定程度上避免WB結果的雜帶問題。 單抗制備過程： 第一步：參照多抗制備的第一步。 第二步：細胞融合。細胞在融合的過程中非常脆弱，所以勁道要輕、時間要把控好，一般按照標準的融合方案來，做到能一手畫圓一手畫圈，此步需要向郭靖童鞋學習，手不要抖則基本達標，可以在融合板里看到很多圓溜溜的單克隆。 第三步：亞克隆。基本上程序化操作，對細胞吹打不要太狠就行。 第四步：篩選檢測。細胞融合及亞克隆后都要對細胞上清進行篩選檢測。細胞單克隆在生長過程中容易因為外力散落成不規(guī)則形狀而影響判斷，或許一個很好的陽性克隆就這么被忽略掉了。所以千萬不要讓你的板子磕到了，尤其是融合的細胞板換液時更是要極其小心。當然，如果不嫌麻煩可以把融合板的單克隆挑到新的細胞板再進行檢測。 第五步：腹水制備。將篩選的陽性單抗細胞株注射到小鼠腹腔，經(jīng)過一段時間小鼠腹腔會產(chǎn)生含高濃度單抗的腹水。注射的細胞數(shù)量不宜過多或過少，過少會導致不生成腹水或周期過長，過多會導致小鼠過早死亡。一般一只小鼠腹腔注射10^6個細胞即可，大約2周即可取腹水。 第六步：參照多抗制備的第三步。 2017315161731919.jpg 一抗選擇 如果有現(xiàn)貨，就不用花時間精力再去自己制備啦，快來get現(xiàn)貨一抗選擇新技能！ ①抗體的說明書中明確指明可用于WB檢測的是首選。但沒寫不表示不能做，可能廠商沒有驗證，如果確實需要這個或者只有這一個，可以向廠商申請試用裝哦。 ②抗體適用的種屬也是需要考慮的。說明書中也會寫明，如果研究樣本的來源物種不在列表里，也并不代表就不能使用，不過最好不用。當然抗體的適用性與不同物種統(tǒng)一蛋白的序列相似性有關，用信息學的方法比對一下可以預測抗體是否可用，如果同源性較高的話還是可以選擇的。 ③抗原類型也需要審視。免疫原不限于蛋白，菌體或細胞都可以作為免疫原，在選擇時要進行區(qū)分。比如要檢測的是蛋白的區(qū)段或同型物，就要選擇用含此片段域的免疫原制備出的抗體。 ④如果一抗是未標記的，后續(xù)還需使用二抗，則選擇的一抗來源物種與樣本來源物種要避免相同導致交叉反應。比如檢測大鼠組織內(nèi)目的蛋白，則最好選兔抗鼠的一抗，而不選擇小鼠來源的一抗。如果一抗是標記的，則可以不考慮這個問題。