Roche 454、Illumina、Solexa和ABI SOLiD為主的三個(gè)測(cè)序平臺(tái)，目前最主流的二代測(cè)序平臺(tái)是 Illumina 所生產(chǎn)的測(cè)序儀，包括 MiSeq 系列、 HiSeq 系列、 NextSeq系列等。另外的還包括羅氏公司的 454 測(cè)序儀（目前已關(guān)閉）、華大基因的 BGI-CG 測(cè)序儀以及 Life Technology（已被 Thermo Fisher 收購）的 Ion Torrent 等。

Illumina測(cè)序儀性能參數(shù)

　　聯(lián)川生物公司目前所采用的測(cè)序儀為Illumina Hiseq、MiSeq、NextSeq及NovaSeq，其性能簡(jiǎn)介如下：

　　MiSeq系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)廣泛的測(cè)序應(yīng)用，它能夠自動(dòng)生成雙端讀取，進(jìn)行2500萬條測(cè)序read和2 x 300 bp的讀長(zhǎng)，每次運(yùn)行可產(chǎn)生15 Gb數(shù)據(jù)。它使用的文庫制備試劑盒是為多個(gè)應(yīng)用而優(yōu)化的，包括靶向基因、小型基因組、擴(kuò)增子測(cè)序以及16S元基因組等。

　　HiSeq 2500系統(tǒng)特有兩種運(yùn)行模式，快速運(yùn)行和高產(chǎn)出運(yùn)行模式，能夠同時(shí)處理一個(gè)或兩個(gè)流動(dòng)槽。這提供了一個(gè)靈活、可擴(kuò)展的平臺(tái)，支持最廣泛的測(cè)序應(yīng)用和研究規(guī)模?？筛鶕?jù)項(xiàng)目需求，在快速運(yùn)行和高產(chǎn)出模式中選擇。HiSeq 3000/HiSeq 4000測(cè)序系統(tǒng)是基于HiSeq 2500系統(tǒng)的成熟性能，利用超高通量HiSeq X系統(tǒng)的圖案化流動(dòng)槽技術(shù)，提供出色的測(cè)序速度和性能。HiSeq 3000/HiSeq 4000提供了高覆蓋度、快速周轉(zhuǎn)和處理各種樣本類型的靈活性，為大規(guī)模的基因組實(shí)驗(yàn)室提供了多個(gè)應(yīng)用的解決方案。

　　NextSeq500主要用于子公司捕獲產(chǎn)品，用于靶向基因測(cè)序（全外、擴(kuò)增子等）。NextSeq系列測(cè)序儀憑借可調(diào)整的產(chǎn)量和很高的數(shù)據(jù)質(zhì)量，可以提供全基因組、轉(zhuǎn)錄組和靶向重測(cè)序?qū)嶒?yàn)。

　　除以上常規(guī)通量的平臺(tái)外，Illumina于2017年初推出了可擴(kuò)展的全新測(cè)序架構(gòu)，由兩臺(tái)儀器組成：NovaSeq 5000和NovaSeq 6000。這兩個(gè)系統(tǒng)之間的差異在于它們運(yùn)行的流動(dòng)槽。NovaSeq 5000可運(yùn)行S1和S2流動(dòng)槽，而NovaSeq 6000可運(yùn)行S1、S2、S3和S4四種不同的流動(dòng)槽。S2格式的流動(dòng)槽最先推出，而S1、S3和S4流動(dòng)槽于2017年的晚些時(shí)候推出。根據(jù)Illumina網(wǎng)站上的系統(tǒng)參數(shù)，NovaSeq測(cè)序系統(tǒng)的產(chǎn)量范圍在167 Gb至6 Tb，每次運(yùn)行的reads數(shù)量在16-200億。以S2流動(dòng)槽為例，它每次運(yùn)行最多可測(cè)序16個(gè)人類基因組，或132個(gè)外顯子組或轉(zhuǎn)錄組。

　　從以上各平臺(tái)的介紹來看，Illumina產(chǎn)出的測(cè)序儀數(shù)據(jù)通量越來越高，NovaSeq6000的通量已達(dá)6000Gb，與高通量測(cè)序發(fā)展之初的幾Gb、幾十Gb相比，通量提高了成百上千倍。

高通量測(cè)序的過程及原理介紹

　　高通量測(cè)序技術(shù)的一般過程是將DNA（或cDNA）隨機(jī)片段化，加上接頭序列，制備用于上機(jī)測(cè)序的文庫，通過對(duì)文庫中數(shù)以萬計(jì)的克隆（colony）進(jìn)行延伸反應(yīng)，檢測(cè)對(duì)應(yīng)的信號(hào)獲取序列信息，最終通過數(shù)據(jù)分析來挖掘序列中的科學(xué)問題。幾種不同測(cè)序平臺(tái)的原理及步驟如下：

　　（1）Roche 454平臺(tái)

　　Roche 454測(cè)序系統(tǒng)是第一個(gè)商業(yè)化運(yùn)營(yíng)二代測(cè)序技術(shù)的平臺(tái)，也是首選將焦磷酸測(cè)序應(yīng)用在測(cè)序技術(shù)上的平臺(tái)。測(cè)序原理如下：

　　1）DNA文庫制備

　　454測(cè)序系統(tǒng)的文件構(gòu)建方式和illumina的不同，它是利用噴霧法將待測(cè)DNA打斷成300-800bp長(zhǎng)的小片段，并在片段兩端加上不同的接頭，或?qū)⒋郎y(cè)DNA變性后用雜交引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，連接載體，構(gòu)建單鏈DNA文庫。

　?。?）Emulsion PCR （乳液PCR，其實(shí)是一個(gè)注水到油的獨(dú)特過程）

　　454當(dāng)然DNA擴(kuò)增過程也和illumina的截然不同，它將這些單鏈DNA結(jié)合在水油包被的直徑約28um的磁珠上，并在其上面孵育、退火。

　　乳液PCR最大的特點(diǎn)是可以形成數(shù)目龐大的獨(dú)立反應(yīng)空間以進(jìn)行DNA擴(kuò)增。其關(guān)鍵技術(shù)是“注水到油”（水包油），基本過程是在PCR反應(yīng)前，將包含PCR所有反應(yīng)成分的水溶液注入到高速旋轉(zhuǎn)的礦物油表面，水溶液瞬間形成無數(shù)個(gè)被礦物油包裹的小水滴。這些小水滴就構(gòu)成了獨(dú)立的PCR反應(yīng)空間。理想狀態(tài)下，每個(gè)小水滴只含一個(gè)DNA模板和一個(gè)磁珠。

　　這些被小水滴包被的磁珠表面含有與接頭互補(bǔ)的DNA序列，因此這些單鏈DNA序列能夠特異地結(jié)合在磁珠上。同時(shí)孵育體系中含有PCR反應(yīng)試劑，所以保證了每個(gè)與磁珠結(jié)合的小片段都能獨(dú)立進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并且擴(kuò)增產(chǎn)物仍可以結(jié)合到磁珠上。當(dāng)反應(yīng)完成后，可以破壞孵育體系并將帶有DNA的磁珠富集下來。進(jìn)過擴(kuò)增，每個(gè)小片段都將被擴(kuò)增約100萬倍，從而達(dá)到下一步測(cè)序所要求的DNA量。

　　（3）焦磷酸測(cè)序

　　測(cè)序前需要先用一種聚合酶和單鏈結(jié)合蛋白處理帶有DNA的磁珠，接著將磁珠放在一種PTP平板上。這種平板上特制有許多直徑約為44um的小孔，每個(gè)小孔僅能容納一個(gè)磁珠，通過這種方法來固定每個(gè)磁珠的位置，以便檢測(cè)接下來的測(cè)序反應(yīng)過程。

　　測(cè)序方法采用焦磷酸測(cè)序法，將一種比PTP板上小孔直徑更小的磁珠放入小孔中，啟動(dòng)測(cè)序反應(yīng)。測(cè)序反應(yīng)以磁珠上大量擴(kuò)增出的單鏈DNA為模板，每次反應(yīng)加入一種dNTP進(jìn)行合成反應(yīng)。如果dNTP能與待測(cè)序列配對(duì)，則會(huì)在合成后釋放焦磷酸基團(tuán)。釋放的焦磷酸基團(tuán)會(huì)與反應(yīng)體系中的ATP硫酸化學(xué)酶反應(yīng)生成ATP。生成的ATP和熒光素酶共同氧化使測(cè)序反應(yīng)中的熒光素分子并發(fā)出熒光，同時(shí)由PTP板另一側(cè)的CCD照相機(jī)記錄，最后通過計(jì)算機(jī)進(jìn)行光信號(hào)處理而獲得最終的測(cè)序結(jié)果。由于每一種dNTP在反應(yīng)中產(chǎn)生的熒光顏色不同，因此可以根據(jù)熒光的顏色來判斷被測(cè)分子的序列。反應(yīng)結(jié)束后，游離的dNTP會(huì)在雙磷酸酶的作用下降解ATP，從而導(dǎo)致熒光淬滅，以便使測(cè)序反應(yīng)進(jìn)入下一個(gè)循環(huán)。

　　由于454測(cè)序技術(shù)中，每個(gè)測(cè)序反應(yīng)都在PTP板上獨(dú)立的小孔中進(jìn)行，因而能大大降低相互間的干擾和測(cè)序偏差。454技術(shù)最大的優(yōu)勢(shì)在于其能獲得較長(zhǎng)的測(cè)序讀長(zhǎng)，當(dāng)前454技術(shù)的平均讀長(zhǎng)可達(dá)400bp，并且454技術(shù)和illumina的Solexa和Hiseq技術(shù)不同，它最主要的一個(gè)缺點(diǎn)是無法準(zhǔn)確測(cè)量同聚物的長(zhǎng)度，如當(dāng)序列中存在類似于PolyA的情況時(shí)，測(cè)序反應(yīng)會(huì)一次加入多個(gè)T，而所加入的T的個(gè)數(shù)只能通過熒光強(qiáng)度推測(cè)獲得，這就有可能導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確。也正是由于這一原因，454技術(shù)會(huì)在測(cè)序過程中引入插入和缺失的測(cè)序錯(cuò)誤。

　?。?）Illumina Solexa平臺(tái)

　　Illumina公司的Solexa和Hiseq應(yīng)該說是目前全球使用量最大的第二代測(cè)序機(jī)器，這兩個(gè)系列的技術(shù)核心原理是相同的，都是采用邊合成邊測(cè)序的方法，它的測(cè)序過程主要分為以下4步：

　　Illumina Solexa測(cè)序原理

　　Illumina Solexa原理：橋式PCR+4色熒光可逆終止+激光掃描成像

　?、貲NA文庫制備——超聲打斷加接頭

　　利用超聲波把待測(cè)的DNA樣本打斷成小片段，目前除了組裝之外和一些其他的特殊要求之外，主要是打斷成200-500bp長(zhǎng)的序列片段，并在這些小片段的兩端添加上不同的接頭，構(gòu)建出單鏈DNA文庫。

　?、贔lowcell——吸附流動(dòng)DNA片段

　　Flowcell是用于吸附流動(dòng)DNA片段的槽道，當(dāng)文庫建好后，這些文庫中的DNA在通過flowcell的時(shí)候會(huì)隨機(jī)附著在flowcell表面的channel上。每個(gè)Flowcell有8個(gè)channel，每個(gè)channel的表面都附有很多接頭，這些接頭能和建庫過程中加在DNA片段兩端的接頭相互配對(duì)（這就是為什么flowcell能吸附建庫后的DNA的原因），并能支持DNA在其表面進(jìn)行橋式PCR的擴(kuò)增。這樣就形成了數(shù)千份相同的單分子簇，被用做測(cè)序模板。

　　③橋式PCR擴(kuò)增與變性——放大信號(hào)

　　橋式PCR以Flowcell表面所固定的接頭為模板，進(jìn)行橋形擴(kuò)增，如圖4.a所示。經(jīng)過不斷的擴(kuò)增和變性循環(huán)，最終每個(gè)DNA片段都將在各自的位置上集中成束，每一個(gè)束都含有單個(gè)DNA模板的很多分拷貝，進(jìn)行這一過程的目的在于實(shí)現(xiàn)將堿基的信號(hào)強(qiáng)度放大，以達(dá)到測(cè)序所需的信號(hào)要求。

　?、軠y(cè)序——測(cè)序堿基轉(zhuǎn)化為光學(xué)信號(hào)

　　測(cè)序方法采用邊合成邊測(cè)序的方法。向反應(yīng)體系中同時(shí)添加DNA聚合酶、接頭引物和帶有堿基特異熒光標(biāo)記的4中dNTP（如同Sanger測(cè)序法）。這些dNTP的3’-OH被化學(xué)方法所保護(hù)，因而每次只能添加一個(gè)dNTP。在dNTP被添加到合成鏈上后，所有未使用的游離dNTP和DNA聚合酶會(huì)被洗脫掉。接著，再加入激發(fā)熒光所需的緩沖液，用激光激發(fā)熒光信號(hào)，并有光學(xué)設(shè)備完成熒光信號(hào)的記錄，最后利用計(jì)算機(jī)分析將光學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)化為測(cè)序堿基。這樣熒光信號(hào)記錄完成后，再加入化學(xué)試劑淬滅熒光信號(hào)并去除dNTP 3’-OH保護(hù)基團(tuán)，以便能進(jìn)行下一輪的測(cè)序反應(yīng)。Illumina的這種測(cè)序技術(shù)每次只添加一個(gè)dNTP的特點(diǎn)能夠很好的地解決同聚物長(zhǎng)度的準(zhǔn)確測(cè)量問題，它的主要測(cè)序錯(cuò)誤來源是堿基的替換，目前它的測(cè)序錯(cuò)誤率在1%-1.5%之間，測(cè)序周期以人類基因組重測(cè)序?yàn)槔?0x測(cè)序深度大約為1周。

　?。?）ABI Solid平臺(tái)

　　Solid測(cè)序技術(shù)是ABI公司于2007年開始投入用于商業(yè)測(cè)序應(yīng)用的儀器。它基于連接酶法，即利用DNA連接酶在連接過程之中測(cè)序，其流程及原理如下：

　?、貲NA文庫構(gòu)建

　　片段打斷并在片段兩端加上測(cè)序接頭，連接載體，構(gòu)建單鏈DNA文庫。

　　②Emulsion PCR

　　Solid的PCR過程也和454的方法類似，同樣采用小水滴emulsion PCR，但這些微珠比起454系統(tǒng)來說則要小得多，只有1um。在擴(kuò)增的同時(shí)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的3’端進(jìn)行修飾，這是為下一步的測(cè)序過程作的準(zhǔn)備。3’修飾的微珠會(huì)被沉積在一塊玻片上。在微珠上樣的過程中，沉積小室將每張玻片分成1個(gè)、4個(gè)或8個(gè)測(cè)序區(qū)域（圖6-a）。Solid系統(tǒng)最大的優(yōu)點(diǎn)就是每張玻片能容納比454更高密度的微珠，在同一系統(tǒng)中輕松實(shí)現(xiàn)更高的通量。

　　③連接酶測(cè)序

　　這一步是Solid測(cè)序的獨(dú)特之處。它并沒有采用以前測(cè)序時(shí)所常用的DNA聚合酶，而是采用了連接酶。Solid連接反應(yīng)的底物是8堿基單鏈熒光探針混合物，這里將其簡(jiǎn)單表示為：3’-XXnnnzzz-5’。連接反應(yīng)中，這些探針按照堿基互補(bǔ)規(guī)則與單鏈DNA模板鏈配對(duì)。探針的5’末端分別標(biāo)記了CY5、Texas Red、CY3、6-FAM這4種顏色的熒光染料。這個(gè)8堿基單鏈熒光探針中，第1和第2位堿基（XX）上的堿基是確定的，并根據(jù)種類的不同在6-8位（zzz）上加上了不同的熒光標(biāo)記。這是Solid的獨(dú)特測(cè)序法，兩個(gè)堿基確定一個(gè)熒光信號(hào)，相當(dāng)于一次能決定兩個(gè)堿基。這種測(cè)序方法也稱之為兩堿基測(cè)序法。當(dāng)熒光探針能夠與DNA模板鏈配對(duì)而連接上時(shí)，就會(huì)發(fā)出代表第1，2位堿基的熒光信號(hào)，圖6-a和圖6-b中的比色版所表示的是第1，2位堿基的不同組合與熒光顏色的關(guān)系。在記錄下熒光信號(hào)后，通過化學(xué)方法在第5和第6位堿基之間進(jìn)行切割，這樣就能移除熒光信號(hào)，以便進(jìn)行下一個(gè)位置的測(cè)序。不過值得注意的是，通過這種測(cè)序方法，每次測(cè)序的位置都相差5位。即第一次是第1、2位，第二次是第6、7位……在測(cè)到末尾后，要將新合成的鏈變性，洗脫。接著用引物n-1進(jìn)行第二輪測(cè)序。引物n-1與引物n的區(qū)別是，二者在與接頭配對(duì)的位置上相差一個(gè)堿基。也即是，通過引物n-1在引物n的基礎(chǔ)上將測(cè)序位置往3’端移動(dòng)一個(gè)堿基位置，因而就能測(cè)定第0、1位和第5、6位……第二輪測(cè)序完成，依此類推，直至第五輪測(cè)序，最終可以完成所有位置的堿基測(cè)序，并且每個(gè)位置的堿基均被檢測(cè)了兩次。該技術(shù)的讀長(zhǎng)在2×50bp，后續(xù)序列拼接同樣比較復(fù)雜。由于雙次檢測(cè)，這一技術(shù)的原始測(cè)序準(zhǔn)確性高達(dá)99.94%，而15x覆蓋率時(shí)的準(zhǔn)確性更是達(dá)到了99.999%，應(yīng)該說是目前第二代測(cè)序技術(shù)中準(zhǔn)確性最高的了。但在熒光解碼階段，鑒于其是雙堿基確定一個(gè)熒光信號(hào)，因而一旦發(fā)生錯(cuò)誤就容易產(chǎn)生連鎖的解碼錯(cuò)誤。

　?。?）Thermo Fisher Scientific Ion Torrent平臺(tái)

　　Ion Torrent 測(cè)序儀是第一個(gè)不需要光學(xué)系統(tǒng)的商業(yè)測(cè)序儀，所采用的技術(shù)為半導(dǎo)體測(cè)序，通過半導(dǎo)體芯片直接將化學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號(hào)，不同于前面提到的任何測(cè)序儀，可以稱之為“二代半”測(cè)序儀。其測(cè)序原理如下：

　　該技術(shù)使用了一種布滿小孔的高密度半導(dǎo)體芯片，一個(gè)小孔就是一個(gè)測(cè)序反應(yīng)池。在半導(dǎo)體芯片的微孔中固定DNA鏈，隨后依次摻入ACGT，當(dāng)DNA聚合酶把核苷酸聚合到延伸中的DNA鏈上時(shí)，會(huì)釋放出一個(gè)氫離子，反應(yīng)池中的PH發(fā)生改變，位于池下的離子感受器感受到H+離子信號(hào)，H+離子信號(hào)再直接轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號(hào)，從而讀出DNA序列。如果檢測(cè)的DNA鏈上有兩個(gè)相同的堿基，將會(huì)檢測(cè)到電壓雙倍，芯片則記錄兩個(gè)相同的堿基。

　　Ion Torrent半導(dǎo)體測(cè)序技術(shù)的發(fā)明人也是454測(cè)序技術(shù)的發(fā)明人之一——Jonathan Rothberg，它的文庫和樣本制備跟454技術(shù)很像，甚至可以說就是454的翻版，只是測(cè)序過程中不是通過檢測(cè)焦磷酸熒光顯色，而是通過檢測(cè)H+信號(hào)的變化來獲得序列堿基信息。由于對(duì)對(duì)個(gè)相同堿基的判讀是通過電信號(hào)來傳導(dǎo)，Ion Torrent平臺(tái)在聚合酶上進(jìn)行了優(yōu)化，新推出的Hi-Q酶聚合反應(yīng)非?？欤a(chǎn)生的PH值變化的峰更高、更尖、更利于判讀，這在很大程度上提高了Ion Torrent測(cè)序儀判讀Homoploymer區(qū)域時(shí)的準(zhǔn)確性。

　　Ion Torrent相比于其他測(cè)序技術(shù)來說，不需要昂貴的物理成像等設(shè)備，因此，成本相對(duì)來說會(huì)低，體積也會(huì)比較小，同時(shí)操作也要更為簡(jiǎn)單，速度也相當(dāng)快速，除了2天文庫制作時(shí)間，整個(gè)上機(jī)測(cè)序可在2-3.5小時(shí)內(nèi)完成，通量目前是10G左右，但非常適合小基因組和外顯子驗(yàn)證的測(cè)序。是一種經(jīng)濟(jì)、快速、簡(jiǎn)單、規(guī)模可擴(kuò)展的測(cè)序技術(shù)，非常適合擴(kuò)增子測(cè)序的革命性技術(shù)。

　?。?）華大基因BGISEQ平臺(tái)

　　自2013年華大基因收購Complete Genomics公司后，華大基因致力于開發(fā)基因測(cè)序平臺(tái)，還喊出了“打造中國(guó)人自己的測(cè)序平臺(tái)”的口號(hào)。2014年華大推出BGISEQ-1000、BGISEQ-100兩款測(cè)序儀，這兩款測(cè)序儀主要用于基因測(cè)序診斷領(lǐng)域，并于2018年1月被申請(qǐng)注銷，測(cè)序平臺(tái)已從原有的BGISEQ-100、BGISEQ-1000升級(jí)為BGISEQ-50、BGISEQ-500。BGISEQ-500及BGISEQ-50分別于2015、2016年推出，致力于拓展生育健康類測(cè)序業(yè)務(wù)。2017年華大又推出兩款測(cè)序儀MGISEQ-200和MGISEQ-2000，這兩款測(cè)序系統(tǒng)充分實(shí)現(xiàn)了低成本購機(jī)和低成本運(yùn)行，其廣泛的應(yīng)用領(lǐng)域，包括科學(xué)研究、臨床醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、公安司法、環(huán)境工程等，實(shí)現(xiàn)了醫(yī)療和科研領(lǐng)域高通量測(cè)序系統(tǒng)的全面普及。

　　華大基因測(cè)序儀的與之前提到的4個(gè)測(cè)序平臺(tái)有所區(qū)別， BGISEQ/MGISEQ系列測(cè)序儀采用先進(jìn)的聯(lián)合探針錨定聚合技術(shù)（cPAS）和改進(jìn)的DNA納米球（DNB）核心測(cè)序技術(shù)，將DNA分子錨與熒光探針在DNA納米球上進(jìn)行聚合，利用高分辨率成像系統(tǒng)對(duì)光信號(hào)進(jìn)行采集，并通過對(duì)光信號(hào)的數(shù)字化處理，最終獲得待測(cè)DNA序列信息。具體步驟如下：

　　1. DNA提取與片段化

　　準(zhǔn)備樣本 → DNA提取 → DNA片段化處理 → DNA片段末端修復(fù)

　　2. DNA片段擴(kuò)增（納米球技術(shù)DNB）

　　加接頭序列 → 分離出單股DNA → 成環(huán) → 滾環(huán)擴(kuò)增 → 形成DNA納米球（DNB）

　　基因組DNA首先經(jīng)過片段化處理，末端修復(fù)后再加上接頭序列，分離出單股DNA后并環(huán)化形成單鏈環(huán)狀DNA。環(huán)裝DNA在DNA聚合酶的作用下繞著DNA環(huán)不停地轉(zhuǎn)圈，復(fù)制出的上百份拷貝都在一股新DNA上，就像一股毛線卷成了毛線團(tuán)一樣，最后形成一團(tuán)DNA納米球（DNB, DNA Nano Ball），這一步即為滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)（Rolling circle amplification, RCA），可將單鏈環(huán)狀DNA擴(kuò)增2-3個(gè)數(shù)量級(jí)。

　　3. DNA序列識(shí)別

　　DNA納米球附著芯片 → 組合探針錨定連接法測(cè)序

　　DNB納米球經(jīng)過裝載技術(shù)固定在陣列化（Patterned Array）的硅芯片上，芯片每個(gè)位點(diǎn)的蛋白質(zhì)上自動(dòng)附著上去一個(gè)DNB納米球并且不會(huì)發(fā)生堆疊。接下來就是測(cè)序過程了，華大測(cè)序儀采用了聯(lián)合探針錨定聚合(combinatorial Probe Anchor Synthesis，cPAS)技術(shù)進(jìn)行測(cè)序，首先DNA分子錨和熒光探針在DNB上進(jìn)行聚合，隨后高分辨率成像系統(tǒng)對(duì)光信號(hào)進(jìn)行采集，光信號(hào)經(jīng)過數(shù)字化處理后即可獲得待測(cè)序列。

　　4. 分析

　　堿基讀取 → 數(shù)據(jù)比對(duì)和組裝 → 基因組 → 結(jié)果分析

　　5. 技術(shù)優(yōu)勢(shì)

　　與其他二代測(cè)序技術(shù)相比較，DNB測(cè)序技術(shù)具有以下幾個(gè)優(yōu)勢(shì)：

　　 （1）DNB通過增加待測(cè)DNA的拷貝數(shù)而增強(qiáng)了信號(hào)強(qiáng)度，從而提高測(cè)序準(zhǔn)確度；

　　 （2）不同于PCR指數(shù)擴(kuò)增，滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)的擴(kuò)增錯(cuò)誤不會(huì)累積；

　　 （3）DNB與芯片上活化位點(diǎn)的大小相同，每個(gè)位點(diǎn)只固定一個(gè)DNB，保證信號(hào)點(diǎn)之間不產(chǎn)生相互干擾；

　　 （4）陣列化測(cè)序芯片和DNB測(cè)序技術(shù)的結(jié)合，使得成像系統(tǒng)像素和測(cè)序芯片的面積得到最大化利用。

　　華大基因測(cè)序儀測(cè)序過程及原理視頻集錦：http://www.seq500.com/portal/videos.shtml

　　5.高通量測(cè)序模版克隆方法簡(jiǎn)介

　　模板放大即需要把待測(cè)序的核酸擴(kuò)增，如下圖所示，NGS技術(shù)模板擴(kuò)增主要有以下四種策略：

　　（1）乳液PCR【454（Roche），SOLiD（Thermo Fisher），GeneReader（Qiagen），Ion Torrent（Thermo Fisher）】

　　在乳液PCR，片段DNA模板與dNTP、引物和DNA聚合酶包在一個(gè)油滴中。在凝膠中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最后得到成千上萬份相同的DNA序列。

　　（2）固相橋式擴(kuò)增【Illumina】

　　片段DNA分散到Flow cell上，與固定的引物結(jié)合，進(jìn)行橋式擴(kuò)增，從而形成很多DNA簇。

　?。?）固相的模板移位【SOLiD Wildfire（Thermo Fisher）】

　　片段DNA與固定的引物結(jié)合，PCR擴(kuò)增延長(zhǎng)引物得到第二天鏈。然后部分變性，使得自由端可以與鄰近的引物結(jié)合，再次擴(kuò)增，起到放大的效果。

　　6.不同高通量測(cè)序平臺(tái)測(cè)序策略介紹

　　測(cè)序策略包含兩種：邊連接邊測(cè)序（sequencing by ligation, SBL）以及邊合成邊測(cè)序（sequencing by synthesis, SBS）。

　?。?）邊連接邊測(cè)序的測(cè)序原理（SBL）——SOLiD & Complete Genomics

　　簡(jiǎn)單說，SBL測(cè)序就是用1-2個(gè)已知堿基標(biāo)記的探針與目標(biāo)DNA雜交，然后再與下一個(gè)標(biāo)記的探針連接，檢測(cè)標(biāo)記探針的信號(hào)，從而知道目標(biāo)DNA的序列信息。

　　SOLiD的全稱是Sequencing by Oligo Ligation Detection，即寡聚物連接檢測(cè)測(cè)序，其基本原理是通過熒光標(biāo)記的8堿基單鏈DNA探針與模板配對(duì)連接，發(fā)出不同的熒光信號(hào)，從而讀取目標(biāo)序列的堿基排列順序。

　　CG的測(cè)序原理叫組合探針錨定連接（cPAL），利用四種不同顏色標(biāo)記的探針去讀取接頭附近的堿基，探針能夠與DNA片段結(jié)合，T4 DNA連接酶連接探針和anchor，使探針穩(wěn)定結(jié)合，從該探針攜帶的熒光基團(tuán)的顏色為判斷出該位置是何種堿基。當(dāng)一輪反應(yīng)結(jié)束后，去除anchor-prob產(chǎn)物，重復(fù)上一輪步驟測(cè)序下一個(gè)堿基。

　?。?）邊合成邊測(cè)序的測(cè)序原理（SBS）——

　　Qiagen GeneReader，Illumina，Roche454,Ion Torrent

　　SBS這個(gè)術(shù)語是用來描述依賴DNA聚合酶來測(cè)序的方法，但是SBS方法又可以分為循環(huán)可逆終止（CRT）和單堿基添加（SNA）。

　　雖然Qiagen公司的GeneReader也是采用CRT的測(cè)序原理，但我們熟知的還是Illumina的CRT測(cè)序原理。四種dNTP被不同的熒光標(biāo)記，每個(gè)循環(huán)就結(jié)合一個(gè)互補(bǔ)的堿基，拍四次照，四個(gè)照片重合，出現(xiàn)哪種熒光標(biāo)記就可以確定是哪個(gè)堿基。反應(yīng)之后熒光基團(tuán)會(huì)被切除，這樣就露出了3’羥基基團(tuán)（-OH），可以與下一個(gè)堿基連接。

　　另一種SBS測(cè)序方法叫單堿基添加（SNA），454焦磷酸測(cè)序和Ion Torrent都屬于這種測(cè)序原理。SNA的方法依賴單個(gè)信號(hào)來標(biāo)記每個(gè)測(cè)序的堿基。因?yàn)樗荒芙K止反應(yīng)，所以每次只能允許進(jìn)一種堿基來防止繼續(xù)延長(zhǎng)。這樣要是單堿基重復(fù)就會(huì)繼續(xù)讀取。454是第一臺(tái)NGS測(cè)序儀，它的SNA系統(tǒng)是含有特定引物的珠子連同酶混合物一起進(jìn)入Pico Titer Plate，當(dāng)有一個(gè)堿基連入DNA鏈，就會(huì)產(chǎn)生一個(gè)生物熒光信號(hào)，通過相機(jī)捕獲。

　　7.高通量測(cè)序的優(yōu)缺點(diǎn)

　　一般芯片只能檢測(cè)已知位點(diǎn)，而二代測(cè)序則可以幫助科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)許多未知的新的基因和位點(diǎn)，并且具有通量高，速度快、應(yīng)用范圍廣泛的特點(diǎn)。

　　雖然NGS有其優(yōu)勢(shì)，但其本身存在一定的技術(shù)缺陷，例如只能讀取幾十個(gè)到幾百個(gè)堿基長(zhǎng)度的序列，這意味著需要更嚴(yán)格復(fù)雜的序列拼接。測(cè)序結(jié)束后可以獲得海量的數(shù)據(jù)量，但是其質(zhì)量卻有待提高（有報(bào)道，NGS 在序列拼接過程中，錯(cuò)誤率在 0.1-15%范圍內(nèi)）。除此以外，二代測(cè)序建庫過程中存在打斷長(zhǎng)片段DNA環(huán)節(jié)，建庫涉及到PCR擴(kuò)增，會(huì)出現(xiàn)系統(tǒng)偏好性等問題。?