親和層析(affinity chromatography)的應(yīng)用
親和層析的應(yīng)用主要是生物大分子的分離、純化。下面簡(jiǎn)單介紹一些親和層析技術(shù)用于純化各種生物大分子的情況。
1.抗原和抗體
利用抗原、抗體之間高特異的親和力而進(jìn)行分離的方法又稱(chēng)為免疫親和層析。例如將抗原結(jié)合于親和層析基質(zhì)上,就可以從血清中分離其對(duì)應(yīng)的抗體。在蛋白質(zhì)工程菌發(fā)酵液中所需蛋白質(zhì)的濃度通常較低,用離子交換、凝膠過(guò)濾等方法都難于進(jìn)行分離,而親和層析則是一種非常有效的方法。將所需蛋白質(zhì)作為抗原,經(jīng)動(dòng)物免疫后制備抗體,將抗體與適當(dāng)基質(zhì)偶聯(lián)形成親和吸附劑,就可以對(duì)發(fā)酵液中的所需蛋白質(zhì)進(jìn)行分離純化。抗原、抗體間親和力一般比較強(qiáng),其解離常數(shù)為10
8-10?
12M,所以洗脫時(shí)是比較困難的,通常需要較強(qiáng)烈的洗脫條件。可以采取適當(dāng)?shù)姆椒ㄈ绺淖兛乖?、抗體種類(lèi)或使用類(lèi)似物等來(lái)降低二者的親和力,以便于洗脫。
另外金黃色葡萄球菌蛋白A(Protein A)能夠與免疫球蛋白G(Ig G)結(jié)合,可以用于分離各種Ig G。
2.生物素和親和素
生物素(biotion)和親和素(avidin)之間具有很強(qiáng)而特異的親和力,可以用于親和層析。如用親和素分離含有生物素的蛋白等。生物素和親和素的親和力很強(qiáng),其解離常數(shù)為10
15M,洗脫通常需要強(qiáng)類(lèi)的變性條件,可以選擇biotion的類(lèi)似物,如2-iminobiotin、diiminobiotin等降低與avidin
的親和力,這樣可以在較溫和的條件下將其從avidin上洗脫下來(lái)。另外,可以利用生物素和親和素間的高親和力,將某種配體固定在基質(zhì)上。例如將生物素?；囊葝u素與以親和素為配體的瓊脂糖作用,通過(guò)生物素與親和素的親和力,胰島素就被固定在瓊脂糖上,可以用于親和層析分離與胰島素有親和力的生物大分子物質(zhì)。這種非共價(jià)的間接結(jié)合比直接將胰島素共價(jià)結(jié)合與CNBr活化的瓊脂糖上更穩(wěn)定。很多種生物大分子可以用生物素標(biāo)記試劑(如生物素與NHS生成的酯)作用結(jié)合上生物素,并且不改變其生物活性,這使得生物素和親和素在親和層析分離中有更廣泛的用途。
3.維生素、激素和結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白
通常結(jié)合蛋白含量很低,如1000升人血漿中只含有20毫克Vit
-7-10-B12結(jié)合蛋白,用通常的層析技術(shù)難于分離。利用維生素或激素與其結(jié)合蛋白具有強(qiáng)而特異的親和力(解離常數(shù)為10
16M)而進(jìn)行親和層析則可以獲得較好的分離效果。由于親和力較強(qiáng),所以洗脫時(shí)可能需要較強(qiáng)烈的條件,另外可以加入適量的配體進(jìn)行特異性洗脫。
4.激素和受體蛋白
激素的受體蛋白屬于膜蛋白,利用去污劑溶解后的膜蛋白往往具有相似的物理性質(zhì),難于用通常的層析技術(shù)分離。但去污劑溶解通常不影響受體蛋白與其對(duì)應(yīng)激素的結(jié)合。所以利用激素和受體蛋白間的高親和力(10
6-10?
12M)而進(jìn)行親和層析是分離受體蛋白的重要方法。目前已經(jīng)用親和層析方法純化出了大量的受體蛋白,如乙酰膽堿、腎上腺素、生長(zhǎng)激素、嗎啡、胰島素等等多種激素的受體。
5.凝集素和糖蛋白
-D-甲基葡萄糖苷洗脫。同樣,用適當(dāng)?shù)奶堑鞍谆騿翁恰⒍嗵亲鳛榕潴w也可以分離各種凝集素。a-D-甲基甘露糖苷或a-D-吡喃葡萄糖苷的糖蛋白,
麥胚凝集素可以特異的與N-乙酰氨基葡萄糖或N-乙酰神經(jīng)氨酸結(jié)合,可以用于血型糖蛋白A、紅細(xì)胞膜凝集素受體等的分離。洗脫時(shí)只需用相應(yīng)的單糖或類(lèi)似物,就可以將待分離的糖蛋白洗脫下來(lái)。如洗脫伴刀豆球蛋白A吸附的蛋白可以用a-D-吡喃甘露糖苷或a凝集素是一類(lèi)具有多種特性的糖蛋白,幾乎都是從植物中提取。它們能識(shí)別特殊的糖,因此可以用于分離多糖、各種糖蛋白、免疫球蛋白、血清蛋白甚至完整的細(xì)胞。用凝集素作為配體的親和層析是分離糖蛋白的主要方法。
6.輔酶
核苷酸及其許多衍生物、各種維生素等是多種酶的輔酶或輔助因子,利用它們與對(duì)應(yīng)酶的親和力可以對(duì)多種酶類(lèi)進(jìn)行分離純化。例如固定的各種腺嘌呤核苷酸輔酶,包括AMP、cAMP、ADP、ATP、CoA、NAD+、NADP+等等應(yīng)用很廣泛,可以用于分離各種激酶和脫氫酶。
7.多核苷酸和核酸
利用poly-U作為配體可以用于分離mRNA以及各種poly-U結(jié)合蛋白。poly-A可以用于分離各種RNA、RNA聚合酶以及其它 poly-A結(jié)合蛋白。以DNA作為配體可以用于分離各種DNA結(jié)合蛋白、DNA聚合酶、RNA聚合酶、核酸外切酶等多種酶類(lèi)。
8.氨基酸
固定化氨基酸是多用途的介質(zhì),通過(guò)氨基酸與其互補(bǔ)蛋白間的親和力,或者通過(guò)氨基酸的疏水性等性質(zhì),可以用于多種蛋白質(zhì)、酶的分離純化。例如L-精氨酸可以用于分離羧肽酶,L-賴(lài)氨酸則廣泛的應(yīng)用于分離各種rRNA。
9.染料配體
結(jié)合在藍(lán)色葡聚糖中的藍(lán)色染料Cibacron Blue
F3GA是一種多芳香環(huán)的磺化物。由于它具有與NAD+相似的空間結(jié)構(gòu),所以它與各種激酶、脫氫酶、血清清蛋白、DNA聚合酶等具有親和力,可以用于親和層析分離。另外較常用的還有Procion
Red HE3B等。染料作為配體吸附容量高、可以多次重復(fù)使用。但它有一定的陽(yáng)離子交換作用,使用時(shí)應(yīng)適當(dāng)提高緩沖液離子強(qiáng)度來(lái)減少非特異性吸附。
10.分離病毒、細(xì)胞
利用配體與病毒、細(xì)胞表面受體的相互作用,親和層析也可以用于病毒和細(xì)胞的分離。利用凝集素、抗原、抗體等作為配體都可以用于細(xì)胞的分離。例如各種凝集素可以用于分離紅細(xì)胞以及各種淋巴細(xì)胞,胰島素可以用于分離脂肪細(xì)胞等。由于細(xì)胞體積大、非特異性吸附強(qiáng),所以親和層析時(shí)要注意選擇合適的基質(zhì)。目前已有特別的基質(zhì)如Pharmacia公司生產(chǎn)的Sepharose
6MB,顆粒大、非特異性吸附小,適合用于細(xì)胞親和層析。
11.金屬螯合色譜
金屬螯合色譜以及后面介紹的共價(jià)色譜、疏水色譜是一些特殊的親和層析技術(shù)。金屬螯合色譜通常使用亞氨二乙酸(IDA)等螯合劑,它能與Cu2+、Zn2+、Fe2+等作用,生成帶有多個(gè)配位基的金屬螯合物,可以用于生物分子尤其是對(duì)重金屬有較強(qiáng)親和力的蛋白質(zhì)的分離純化。例如Cu2+-IDA配體可以用于分離帶精氨酸的蛋白質(zhì)。
12.共價(jià)色譜
共價(jià)色譜與常規(guī)的親和色譜方法不同之處在于它是利用親和吸附劑與待分離的蛋白質(zhì)的共價(jià)結(jié)合而將其吸附,而后用適當(dāng)?shù)奶幚矸椒▽⒐矁r(jià)鍵打開(kāi)而將蛋白釋放出來(lái)。例如活化的巰基-Sepharose、巰丙基-Sepharose等活化基質(zhì)可以直接與含巰基的蛋白質(zhì)通過(guò)二硫鍵共價(jià)結(jié)合而將其吸附在基質(zhì)上,通過(guò)適當(dāng)?shù)南疵撘喝绨腚装彼?巰基乙醇等還原二硫鍵即可將蛋白質(zhì)洗脫下來(lái)。共價(jià)色譜結(jié)合和洗脫條件一般都很溫和,可以多次重復(fù)使用。
