一、硬件操作
熒光分光光度計在使用時，需要注意開機次序，以保護設(shè)備之間不受影響。熒光光譜儀開機順序一般為先開氙燈，然后開儀器主機，最后開跟儀器連接的計算機。如此操作的原因在于穩(wěn)態(tài)氙燈是高壓點亮，為了避免瞬問脈沖電流對周圍設(shè)備造成影響，需要先開氙燈，等電流穩(wěn)定后再打開周邊的電腦等設(shè)備。關(guān)機順序則相反。
二、軟件操作
熒光定量分析多采用工作曲線法，即以已知量的標準物質(zhì)，按試樣相同方法處理后，配成一系列標準溶液，測定其相對熒光強度和空白溶液的相對熒光強度；扣除空白值后，以熒光強度為縱坐標，標準溶液濃度為橫坐標，繪制工作曲線；然后將處理后的試樣配成一定濃度的溶液，在同一條件下測定其相對熒光強度，扣除空白值后，從工作曲線上求出熒光物質(zhì)的含量。
在用熒光分析法測定某些會引起熒光改變的微量物質(zhì)時，常采用差示熒光法，可使熒光強度的讀數(shù)差距拉大，使熒光強度的降低加大，從而提高方法的靈敏度和準確度。
下面以日立F-4500熒光分光光度計的使用為例，具體介紹如何在儀器上進圖譜掃描、濃度分析等定性、定量測試操作。
1.圖譜掃描(WavelengthScarl)簡明操作：
①打開光譜儀電源開關(guān)(POwER)，5s后再按下氙燈點燈按鈕，當氙燈點燃后，再接通主開關(guān)(MAIN)。此時主開關(guān)上方綠色指示燈連續(xù)閃動三下，然后開計算機、顯示器、打印機。計算機進入操作系統(tǒng)。
②運行FL-Solution控制軟件。
③建立試驗方法(發(fā)射光譜)，設(shè)置測量參數(shù)：點擊快捷欄“Method”后，立即顯示了分析方法(AnalysisMethod)的五個重疊界面，分別為“常規(guī)”(Gen—eral)、“儀器條件”(Instnlinent)、“模擬畫面”(Mmlitor)、“處理”(Processing)、“報告”(Report)。
下面詳細介紹每個界面：單擊“常規(guī)”按鈕，測量方式選擇波長掃描Wave一1ength)；單擊“儀器條件”按鈕，掃描方式選為發(fā)射波長掃描。激發(fā)波長的輸入范圍為200～900nm，發(fā)射起始波長的輸入范圍200～890nm，發(fā)射終止波長的輸入范圍210～900nm。選定合適的掃描速度、延遲時間、發(fā)射單元狹縫、光電倍增管負高壓，設(shè)置發(fā)射單元狹縫、響應(yīng)速度、重復(fù)次數(shù)等參數(shù)。
④進行樣品掃描：將待測樣品倒人四面通光的石英比色皿中，并將其放入儀器的樣品架中。點擊測量按鈕，儀器便開始對樣品進行掃描測量。
⑤存儲掃描譜圖：在文件菜單“另存為”，輸入文件名，按“保存”將數(shù)據(jù)保存。
⑥打印譜圖：打印樣品掃描譜圖。
⑦測試結(jié)束，將比色皿取出，清洗，晾干。退出軟件，關(guān)閉計算機，在軟件上將氙燈熄滅，待其冷卻到室溫時才關(guān)光譜儀主機。
注意：測試結(jié)束不要急于關(guān)閉光譜儀主機電源。務(wù)必等到氙燈冷卻后，才關(guān)光譜儀主機。可以將手放在儀器主機上面左側(cè)的散熱窗口處，感受其溫度，直到其溫度降到室溫時，才能關(guān)閉光譜儀主機。
2.濃度分析簡明操作
光度計法亦稱濃度直讀法，也稱工作曲線法。利用配制的具有梯度的標準樣品，先做出一條標準曲線，然后再反測未知樣品。
①打開光譜儀電源開關(guān)(PowER)，5s后再按下氙燈點燈按鈕，當氙燈點燃后，再接通主開關(guān)(MAIN)。此時主開關(guān)上方綠色指示燈連續(xù)閃動三下，然后開計算機、顯示器、打印機。計算機進入操作系統(tǒng)。
②運行FL—Solution控制軟件。
③建立試驗方法(光度計法)，設(shè)置參數(shù)：測量方式(MeasureHlent)選擇光度計(Photometry)，定量條件：測量類型(Quantitationtype)選擇指定波長(Wavelength)，曲線校正類型(Calibrationtype)選擇一次線性方程，設(shè)置波長數(shù)(Numberofwavelengths)、濃度單位(Concentrationunit)。波長方式(Wavelengthmode)：激發(fā)波長與發(fā)射波長均固定，波長選定后輸入具體值。選定合適的發(fā)射單元狹縫與激發(fā)單元狹縫，設(shè)定光電管負高壓、重復(fù)次數(shù)等參數(shù)。
標準樣品表(Standards)：標準樣品數(shù)目的設(shè)定(Numberofsampies)為1～20間。修訂確認(Update)：當標樣數(shù)確定后，點擊此框后顯示標樣表以供賦值。如果需要臨時插入一個標樣條目，可點擊插入(Insert)鍵；如果需要臨時刪除一個標樣條目，可點擊刪除(Delete)鍵。
④進行樣品測量：放入標準樣品，點擊測量按鈕，儀器便開始對標樣進行測量。未知樣品測量點擊F4鍵，結(jié)束測量點擊F9鍵。
⑤存儲數(shù)據(jù)：在文件菜單“另存為”，輸入文件名，按“保存”將數(shù)據(jù)保存。
⑥打印數(shù)據(jù)。
⑦測試結(jié)束，將比色皿取出，清洗，晾干。退出軟件，關(guān)閉計算機，在軟件上將氙燈熄滅，待其冷卻到室溫時才關(guān)光譜儀主機。
3.三維掃描的簡易操作
當某個樣品不知最佳激發(fā)波長和最佳發(fā)射波長時，利用該功能可自動快速地給出最佳條件，并可供其它特殊分析用。
①打開光譜儀電源開關(guān)，氙燈。
②運行FL-Solution控制軟件。
③建立試驗方法(光度計法)，設(shè)置參數(shù)。
a．General(常規(guī))
MeasuremerLt(測量方式)——選擇3-DScan方式。
b．Instnlment(儀器條件)
Datamode(數(shù)據(jù)方式)——可選擇Fluorescence熒光或Phosphorescerlce磷光。
ExstartWL(激發(fā)起始波長)——200～850nm間選擇。
ExendWL(激發(fā)終止波長)——200～900nm間選擇。
EXsamplinginterval(激發(fā)掃描間距)——1～50nm間選擇。
EMstartwL(發(fā)射起始波長)——200～850nm間選擇。
EMendwL(發(fā)射終止波長)——200～900nm間選擇。
EMsamplinginterval(發(fā)射掃描間距)——1～10nm問選擇。
Scanspeed(掃描速度)——任選。如為了快速，可選30000nm／min。
④進行樣品測量。
⑤存儲數(shù)據(jù)。
⑥打印數(shù)據(jù)。
⑦測試結(jié)束，關(guān)機。
三、工作參數(shù)條件的選擇
1.激發(fā)波長的選擇
該怎么確定激發(fā)波長與發(fā)射波長呢?對許多儀器初學(xué)者來說，這是個令人感到困擾的問題。如果儀器有三維掃描功能，那就比較簡單，放樣品進去，按照說明書要求做三維熒光掃描，可以很方便地確定出合適的激發(fā)波長與發(fā)射波長。如果儀器沒有三維掃描功能，一般的方法如下。
首先，將儀器的激發(fā)波長（λem）先設(shè)定為200nm，然后進行發(fā)射(EM)模式掃描，發(fā)射波長（λem）掃描范圍暫設(shè)定為210～800nm，記錄所有出現(xiàn)的峰值波長；改變激發(fā)波長（λem）后再掃描，如第二次發(fā)射圖譜中的某個(或某些)峰的位置沒有位移(或位移很少)，一般來說這個(或這些)峰就是熒光峰；因為熒光峰的位置是不隨激發(fā)波長的改變而改變的，僅是峰高(或峰面積)發(fā)生改變。
然后，將確定的熒光峰的波長作為發(fā)射波長(λem)固定下來，再做激發(fā)波長(Ex)的掃描，激發(fā)波長的范圍要小于發(fā)射波長；如果僅出一個激發(fā)峰則很簡單確立下來，再將這個波長固定下來重新做真正的發(fā)射波長(EM)掃描，可以得到具有良好信噪比的結(jié)果；如果做激發(fā)波長(EX)掃描后出現(xiàn)幾個峰，則根據(jù)經(jīng)驗來選擇，一般應(yīng)選擇峰形、高度適合且有一定帶寬的峰作為激發(fā)波長。也可以參考熒光光譜的特性——激發(fā)光譜與發(fā)射光譜呈鏡像的特點來確定激發(fā)波長。
2.濾光片的選擇
在進行發(fā)射圖譜掃描分析時，根據(jù)斯托克斯定律，設(shè)置的激發(fā)波長要比發(fā)射波長短，例如，激發(fā)波長λex=260nm，則發(fā)射起始波長應(yīng)該從大于260nm的波長開始，比如270nm，發(fā)射結(jié)束波長為870nm。這樣一來，在激發(fā)光的2倍波長(520nm)、3倍波長(780nm)處都會出現(xiàn)激發(fā)波長的尖銳的倍頻峰，若與熒光光譜峰重疊，將會對測試產(chǎn)生干擾，需選用合適的濾光片將其濾掉。
倍頻峰就是激發(fā)光的散射峰，雖然波長掃描到雙倍波長的時候出現(xiàn)，但實際波長卻是激發(fā)波長，可以通過增加高通濾光片來去除倍頻峰。高通濾光片一般放在發(fā)射處，片上都標明其可以濾除的最大波長。也就是說，體系中增加高通濾光片后，比其上所標波長低的光，也包括這些光的二倍波長光、三倍波長光，會被濾掉；而比其所標波長高的光則可以順利通過。
3.狹縫的設(shè)置
熒光強度跟很多因素有關(guān)，如分子結(jié)構(gòu)、存在狀態(tài)、溶液濃度或薄膜厚度、溫度、選擇的激發(fā)波長、測試狹縫寬度等因素。熒光強度在不同儀器上的測量值存在較大差異，不具有可比性，但是其峰位還是較容易確定的，可以用來判斷何種物質(zhì)。進行熒光定量分析，必須固定一些條件。
狹縫的大小對熒光強度很重要，狹縫大小可根據(jù)你所測物質(zhì)的熒光強度大小作出適當?shù)恼{(diào)整。在同一濃度，如熒光強度過大，超過儀器量程，可減小狹縫。但是，需要指出的是，不能僅憑狹縫的大小來改變熒光強度，還要考慮分辨率的問題。對于熒光掃描而言，狹縫加大可以使熒光強度提高同時重現(xiàn)性得到提高，但是分辨率隨之降低。狹縫決定分辨率，儀器其它結(jié)構(gòu)已經(jīng)固定(光柵的刻線數(shù)、焦距以及綜合的線色散系數(shù))，狹縫大小就決定分辨率的高低。對于實際使用，狹縫大小需要和測定的峰的半峰寬相匹配，過大，峰就變形了。狹縫大小也決定了光通量大小。按照經(jīng)驗數(shù)值，狹縫開大1倍，光通量將增大4倍。
4.步長的設(shè)置
測量的步長小，測量會慢些，好處足圖譜細膩些；步長大，測量速度快，譜圖就顯得粗糙些。步長設(shè)置最好小于需要測量最小半峰寬的1／5，因為步長會與分辨率相關(guān)的。原則上，步長應(yīng)小于3倍的狹縫寬度。
四、測試注意事項
熒光強度容易受外界因素的影響，如樣品池、激發(fā)光源、溫度、溶液的pH值、溶劑性質(zhì)、其它溶質(zhì)、表面活性劑等都會造成熒光強度的變化。嚴格控制測試條件對熒光分析來說至關(guān)重要。
①樣品應(yīng)盛在四面透光的石英比色皿(熒光池)中，如果是揮發(fā)性樣品應(yīng)使用帶塞的熒光池。
②在熒光分析時，為了得到穩(wěn)定可靠的數(shù)據(jù)，一般需要開機預(yù)熱氙燈大約30min。如果儀器光源采用的是閃爍氙燈，預(yù)熱時間可以縮短到10min左右。對某些易感光、易分解的熒光物質(zhì)，盡量采用長波長、低入射光強度及短時間光照。
③溫度變化可引起熒光強度的改變。通常降低溫度，有利于提高熒光量子產(chǎn)率，熒光強度增大。溫度影響熒光強度的顯著程度因樣品而異，大部分熒光物質(zhì)的熒光強度受溫度影響不大，測試溫度變化不超過±3℃，對測試結(jié)果幾乎無影響。
④當熒光物質(zhì)是弱酸或弱堿時，溶液的pH對熒光強度有較大影響。因為弱酸或弱堿在不同酸度中，分子和離子的電離平衡會發(fā)生改變，而熒光物質(zhì)的熒光強度會因其離解狀態(tài)發(fā)生改變。以苯胺為例：在pH=7～12的溶液中會產(chǎn)生藍色熒光，在pH<2或pH>13的溶液中都不產(chǎn)生熒光。再如，維生素B2(核黃素)在430～440nm藍光照射下會發(fā)出綠色熒光，λem為535nm。它在pH=6～7的溶液中熒光強度最大，而在pH=11時熒光消失；但在堿性溶液經(jīng)光線照射發(fā)生分解作用或在酸性KMnOt氧化下都會生成熒光強度比維生素B2強得多的黃光素，并可溶于氯仿。利用此性質(zhì)可提高測定的靈敏度和選擇性。
⑤分子結(jié)構(gòu)中存在ππ共軛的熒光物質(zhì)在極性溶劑中，熒光效率顯著增強。溶液表面活性劑的加入能夠顯著提高熒光強度。
⑥瑞利散射和拉曼散射是溶劑的兩種散射光，應(yīng)注意不要誤把瑞利散射和拉曼散射光譜當做熒光光譜。瑞利散射光波長與激發(fā)光波長相同，拉曼散射與激發(fā)光波長不同，而熒光物質(zhì)的熒光波長與激發(fā)光波長無關(guān)，因此可以通過選擇適當?shù)募ぐl(fā)波長將拉曼散射光與熒光分開。在測試時選擇合適的狹縫寬度，或者空白扣除，也可以對散射光的影響進行校正。
⑦熒光物質(zhì)分子與溶液中其它物質(zhì)分子之問作用導(dǎo)致熒光強度降低，常見的熒光猝滅劑，如鹵素離子、重金屬離子、O2、硝基化物質(zhì)、重氮化合物等。溶液中的溶解氧也能引起幾乎所有的熒光物質(zhì)產(chǎn)生不同程度的熒光熄滅現(xiàn)象，因此，在較嚴格的熒光實驗中必須除O2。
⑧測試過程中注意不要肉眼盯著氙燈光源看，以防對眼睛造成損傷。
⑨儀器房應(yīng)注意經(jīng)常通風(fēng)，避免產(chǎn)生的臭氧在室內(nèi)富集。
