膠體金（金標(biāo)）檢驗(yàn)法
膠體金是一種常用的標(biāo)記技術(shù)，有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。近年已在各種生物學(xué)研究中廣泛使用。免疫膠體金技術(shù)的基本原理是：氯金酸?(HAuCl4)在還原劑作用下，可聚合成一定大小的金顆粒，形成帶負(fù)電的疏水膠溶液。由于靜電作用而成為穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，故稱(chēng)膠體金。膠體金標(biāo)記，實(shí)質(zhì)上是蛋白質(zhì)等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過(guò)程。免疫金標(biāo)記技術(shù)(Immunogold?labelling?techique)?主要利用了金顆粒具有高電子密度的特性，在金標(biāo)蛋白結(jié)合處，在顯微鏡下可見(jiàn)黑褐色顆粒，當(dāng)這些標(biāo)記物在相應(yīng)的配體處大量聚集時(shí)，肉眼可見(jiàn)紫色斑點(diǎn)，因而用于定性或半定量的快速免疫檢測(cè)方法中。
為什么霍亂可以用膠體金（金標(biāo)）檢驗(yàn)法進(jìn)行快速篩查?？
霍亂弧菌快速檢測(cè)卡是利用單克隆抗體膠體金標(biāo)記技術(shù)和膜層析技術(shù)研制而成，用于定性檢測(cè)樣本中可能存在的霍亂弧菌的特異性抗原?A及O139血清型?。首先按常規(guī)方法制備并篩選出效價(jià)高的抗O1群A抗原和抗O139抗原的單抗細(xì)胞株。然后采用枸緣酸鈉還原法制備膠體金顆粒，選擇玻璃纖維吸附最適濃度的金標(biāo)抗體。按常規(guī)方法免疫家兔，制備霍亂弧菌的多克隆抗體。根據(jù)檢測(cè)對(duì)象（疑似病人糞便）的特殊性，研制了特異的稀釋液。一方面可裂解細(xì)菌，釋放抗原，提高檢測(cè)敏感性，另一方面可起到防止污染的作用?！?經(jīng)二年多的反復(fù)試制，我公司完成的霍亂弧菌?O1群（O139）快速檢測(cè)試紙，其對(duì)霍亂弧菌最低敏感性10分鐘內(nèi)106菌/ml陽(yáng)性，達(dá)到臨床最低檢出量的要求，符合衛(wèi)生部《霍亂防治手冊(cè)》要求，且對(duì)高濃度的菌液109?菌/ml無(wú)前置反應(yīng)；用萃取液、正常人糞便標(biāo)本及其它大腸中寄生菌進(jìn)行的特異性鑒定表明，?該試紙條特異性為100%?
金特敏???霍亂快速檢測(cè)卡的特點(diǎn)是什么？
最低檢出量?：不低于?105cfu/ml適合臨床需要。?快速出結(jié)果?：稀釋直接裂解細(xì)菌，?10分鐘觀察結(jié)果滿足疾病控制要求。?便利使用?：獨(dú)立包裝，"插"式設(shè)計(jì)，操作簡(jiǎn)捷，避免二次污染。?穩(wěn)定性好?：無(wú)須冷藏，常溫保存?18個(gè)月。
質(zhì)控線C線的意義是什么？
將羊抗鼠抗體包被于?NC膜，形成對(duì)照線C，同時(shí)在NC膜的一端固定膠體金標(biāo)記的霍亂弧菌A抗原單隆抗體。檢測(cè)時(shí)，樣品依靠層析作用，沿著NC膜向前爬行。不論樣品中是否含霍亂弧菌，也就是說(shuō)無(wú)論金標(biāo)抗體是否結(jié)合霍亂弧菌抗原，都有一部分能與羊抗鼠抗體結(jié)合，形成紫色線的對(duì)照線C，即出現(xiàn)質(zhì)控線C線，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)是有效的。
為什么T線可作為檢測(cè)線？
采用雙抗體夾心法，在?NC膜包被羊抗鼠抗體同時(shí)，在另一側(cè)包被霍亂弧菌O1（O139）多抗，形成T檢測(cè)線。疑似霍亂病人的糞便樣品中若含有一定數(shù)量的霍亂弧菌，則與檢測(cè)端的金標(biāo)抗體結(jié)合，向前爬行經(jīng)過(guò)檢測(cè)線時(shí)，金標(biāo)抗體－抗原復(fù)合物再與多抗結(jié)合，在局部沉積，出現(xiàn)紫色線，形成T檢測(cè)線，反之則不出現(xiàn)紫色T檢測(cè)線。?
為什么C、T兩條線都顯色才可判為陽(yáng)性？
因?yàn)椴捎秒p抗體夾心法，同時(shí)在?NC膜上包被了羊抗鼠抗體和霍亂弧菌O1多抗，被檢樣品中若含霍亂弧菌，在與標(biāo)記在檢測(cè)卡檢測(cè)端的膠體金霍亂抗原結(jié)合后，沿NC膜爬行，與在T線形成膠體金—霍亂弧菌單克隆抗體—霍亂弧菌A（O139）抗原—霍亂弧菌O1多抗混合物，與C線形成膠體金—霍亂弧菌單克隆抗體—羊抗鼠抗體混合物，即出現(xiàn)兩條線才為陽(yáng)性?。
只有C線，無(wú)T線說(shuō)明了什么？
此結(jié)果判定為陰性，在檢測(cè)線?T線處，無(wú)膠體金免疫復(fù)合物形成，故不顯色；在質(zhì)控C線處形成膠體金—霍亂弧菌單克隆抗體—羊抗鼠抗體混合物，說(shuō)明膠體金標(biāo)記正常，實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效。
C、T兩線都不顯色怎么辦？
若經(jīng)重復(fù)檢驗(yàn)后，?C、T兩線仍不顯色，說(shuō)明膠體金標(biāo)記失敗，檢測(cè)卡因受潮等原因失效。
為什么會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性？
目前按衛(wèi)生部《霍亂防治手冊(cè)》要求，霍亂弧菌培養(yǎng)陽(yáng)性才可認(rèn)定為確診病例，假陽(yáng)性是針對(duì)霍亂弧菌培養(yǎng)陽(yáng)性結(jié)果（金標(biāo)準(zhǔn)）而言，根據(jù)臨床驗(yàn)證應(yīng)用以來(lái)的結(jié)果顯示，我們認(rèn)為可能與以下三種情況有關(guān)：
*?根據(jù)本檢測(cè)卡的檢測(cè)原理，是檢測(cè)疑似病人糞便中的霍亂弧菌?O1?A抗原或O139抗原，與是否含有活菌無(wú)關(guān)，只要感染過(guò)霍亂弧菌，且達(dá)到一定的抗原量即可顯示檢測(cè)陽(yáng)性，病人即使服藥后亦可檢出陽(yáng)性。
*?在某省的臨床驗(yàn)證中，曾出現(xiàn)?104/ml即可檢出的情況，高于衛(wèi)生部《霍亂防治手冊(cè)》中106?-108/ml的檢出線。曾有一檢測(cè)卡陽(yáng)性標(biāo)本，經(jīng)4次堿胨水增菌后，才培養(yǎng)出活菌。?
*?在經(jīng)中國(guó)藥品生物制品檢定所的企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中，本檢測(cè)卡與副溶血弧菌、溶藻弧菌、麥?zhǔn)匣【?、河弧菌、?chuàng)傷弧菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌、氣單胞菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌等?14種常見(jiàn)腸道細(xì)菌無(wú)交叉反應(yīng)，除此外是否還有其他的交叉反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)菌，我們正在探討。
假陰性會(huì)出現(xiàn)嗎？
任何診斷試劑都有一定的漏診率和誤診率，由于霍亂的特殊性，我們盡量提高檢出率，提高靈敏度、特異度，減少漏診（假陰性）。三個(gè)省級(jí)疾控中心?1680例臨床檢測(cè)的靈敏度是98.61%，特異度是100%。出現(xiàn)假陰性可能與樣品中的細(xì)菌含量低、或檢測(cè)卡失效等因素（受潮、膠體金標(biāo)記失敗等）有關(guān)。?
為什么一定要用稀釋液？
為使檢測(cè)端的金標(biāo)單抗與霍亂弧菌?O1菌體抗原A（O139）更充分地結(jié)合，要使霍亂弧菌抗原充分暴露，有必要使用稀釋液裂解細(xì)菌，這?一方面可提高檢測(cè)敏感性，另一方面可起到防止污染的作用。我們查閱了有關(guān)文獻(xiàn)，并多次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，選擇了特異性的稀釋液裂解細(xì)菌，所以在檢測(cè)時(shí)，一定要將標(biāo)本與稀釋液充分混合，裂解細(xì)菌，只有這樣才能提高檢出率，達(dá)到盡早篩查疑似病人，控制疫情的目的。?
-
焦點(diǎn)事件
