Isotype胞內(nèi)染色有哪些學(xué)問？來看看這篇文章怎么說
對科研黨來說，流式細(xì)胞術(shù)一點都不陌生，它以自己特有的方式從細(xì)胞蛋白水平定量檢測目標(biāo)蛋白的表達(dá)，并且能get到目標(biāo)蛋白在各個細(xì)胞亞群中的表達(dá)，同時在細(xì)胞功能上也有很重要的作用，包括細(xì)胞凋亡，細(xì)胞周期，細(xì)胞增殖等等。
流式細(xì)胞術(shù)以細(xì)胞為研究對象，在流式細(xì)胞儀的作用下定量檢測樣品細(xì)胞的物理化學(xué)特征，其定量是以光信號為基礎(chǔ)的，通過分析接收到的激光照射到細(xì)胞后的散射光信號和熒光信號完成定量分析。散射光信號是激光照射到細(xì)胞后散射形成的，散射光的波長與激光的波長相同；熒光信號是細(xì)胞上結(jié)合的熒光素被激光激發(fā)后產(chǎn)生的，一般熒光信號的波長要長于激發(fā)它的激光的波長，流式細(xì)胞儀通過光路系統(tǒng)將熒光信號根據(jù)波長的不同分成不同的部分，不同波長的熒光分別進(jìn)入各自的接收器被流式細(xì)胞儀接收和分析。
在大部分流式表面染色的實驗中，不需要特定緩沖液來支持，同時在表面染色中的陰性對照通常是不染色的 blank 和同型對照 isotype。所以針對表面 marker 的流式實驗設(shè)計會顯得比較容易。在此基礎(chǔ)上，如果您的實驗中需要用流式細(xì)胞術(shù)來探索胞內(nèi)的指標(biāo)，您還需要考慮其他的一些因素。
1選擇合適的濃度
在細(xì)胞表面染色的實驗中，抗體的合適濃度是十分重要。一樣地，在胞內(nèi)染色實驗中依然是十分關(guān)鍵?？贵w的推薦溶度可以在我們官網(wǎng)的 Technical Data Sheet 上的推薦濃度部分中找到，如下圖所示：
BioLegend 提供的推薦濃度都是經(jīng)過 3-5 點的滴定，從中選擇了一個最好的信噪比的濃度作為推薦濃度。
雖然推薦濃度是經(jīng)過我們廠內(nèi)驗證，但是由于您的實驗環(huán)境，條件和樣品的不同，您還需要進(jìn)行抗體滴定來確認(rèn)最適合您的實驗體系的抗體濃度。如果在實驗中使用的抗體不足，您可能檢測不到目的群體，或者目的群體的分群不夠理想。然而，倘若您在實驗中使用了過量的抗體，很可能會出現(xiàn)所有細(xì)胞群體的背景信號增加，這樣在數(shù)據(jù)分析的時候就會出現(xiàn)偏差，這種現(xiàn)象常稱之為“胞內(nèi)漂移”（intracellular shift）。
2選擇合適的緩沖液
如果需要檢測胞內(nèi)指標(biāo)，就需要先對細(xì)胞進(jìn)行固定（fixation），然后將細(xì)胞進(jìn)行透化（permeabilization）。最常見的固定劑是多聚甲醛溶液（paraformaldehyde， PFA），它能穩(wěn)定細(xì)胞膜結(jié)果，之后通過去垢劑或者酒精再對細(xì)胞進(jìn)行透化處理。細(xì)胞經(jīng)過透化處理之后，抗體就可以直接進(jìn)去入細(xì)胞內(nèi)部去結(jié)合胞內(nèi)的目標(biāo)蛋白。目的蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位，會決定最適合于實驗的緩沖液。
胞漿內(nèi)蛋白
對于胞漿內(nèi)蛋白的染色，比如細(xì)胞因子，通常需要進(jìn)行兩步法的固定和透化處理，BioLegend 提供了兩種適用的 buffer 套裝可供選擇：
a）Fixation Buffer 和 Intracellular Staining Permeabilization Wash Buffer (10X)。
b）新發(fā)布的 Cyto-Fast? Fix/Perm Buffer Set。
如上所見，第一個選項中 fixation buffer 和 intracellular staining Permeabilization wash buffer 是獨立包裝的兩個產(chǎn)品，而新發(fā)布的 Cyto-Fast? Fix/Perm Buffer Set 是包含了 fix/perm buffer 和 perm wash buffer 的套裝，并且套裝是一并經(jīng)過 QC 質(zhì)控，相比于傳統(tǒng)的 fixation buffer 和 Intracellular Staining Permeabilization Wash Buffer (10X)，Cyto-Fast? Fix/Perm Buffer Set 在信噪比上的表現(xiàn)更好。這樣的話，可以提供更穩(wěn)定及可重復(fù)的結(jié)果。
下圖為分別使用了 fixation buffer/intracellular staining Permeabilization wash buffer 和 Cyto-Fast? Fix/Perm Buffer Set 在極化的人 Th1 細(xì)胞的胞內(nèi)染色結(jié)果：
核內(nèi)蛋白
如果您的研究是研究核內(nèi)的指標(biāo)，比如轉(zhuǎn)錄因子，不僅僅需要緩沖液透化外部的細(xì)胞膜，還需要透化細(xì)胞核核膜，使得抗體可以進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，結(jié)合核內(nèi)蛋白。為了做好核內(nèi)蛋白的染色，我們推薦使用 True-Nuclear? Transcription Buffer Set 來作為實驗緩沖液。這是我們 FOXP3 Fix/Perm Buffer Set 的升級版。某些核膜透化的buffer會影響串聯(lián)染料的表現(xiàn)，增加溢漏到串聯(lián)染料的 donor 通道的熒光補償。
人全血使用APC/Cy7 CD3抗體（藍(lán)色和紅色柱狀圖）或APC/Fire? 750（綠色和紫色的柱狀圖）染色，然后進(jìn)行紅細(xì)胞裂解，清洗之后再按以下條件進(jìn)行固定：A、使用FOXP3 Fix/Perm Buffer固定后用FOXP3 Perm Buffer進(jìn)行透化（紫色和紅色）；B、使用True-Nuclear? Fix Buffer固定，再用True-Nuclear? Perm Buffer透化（綠色和藍(lán)色）。
從上圖中可以看到，使用 FOXP3 buffer 套裝時，APC/Fire? 及 APC/Cy7 溢漏到 APC 通道的補償值明顯大于 True-Nuclear? Transcription Buffer Set.
磷酸化蛋白
當(dāng)我們使用磷酸化特異性的抗體分析細(xì)胞內(nèi)的蛋白磷酸化水平時，就需要能夠比胞漿內(nèi)染色及核內(nèi)染色更強力的固定破膜劑。在做磷酸化蛋白的染色時，推薦使用基于甲醇的，專門為磷酸化蛋白染色優(yōu)化的 True-Phos? Perm Buffer。
上圖中是人全血使用（右圖）或不使用（左圖）IL-6刺激15分鐘之后，使用RBC/Lysis Fixation Solution 進(jìn)行裂紅處理，然后使用True-Phos? Perm Buffer進(jìn)行透化，之后使用CD3 APC和 STAT3 pY705（clone 13A3-1）FITC進(jìn)行染色。
由于 True-Phos? Perm Buffer 含有甲醇，在使用時需要注意用于表面染色的抗體是否適用于含有甲醇的緩沖液。甲醇有時會改變甚至破壞抗體識別的表位。所以，在正式實驗之前，需要通過預(yù)實驗或者文獻(xiàn)來確定表面染色所用的抗體是否適用于甲醇固定的樣品，BioLegend 的網(wǎng)頁 fixation page 中，提供了我們廠內(nèi)測試的一些克隆號在 4% PFA 固定之后的表現(xiàn)，雖然它們不是甲醇固定，但是依然是您參考的一個方向。如果您選用的抗體克隆不適用于甲醇，那可以嘗試在固定之前對表面指標(biāo)進(jìn)行標(biāo)記，不過需要注意的是選用甲醇不敏感的熒光素，如下表所示：
“特殊照顧對象”
凡事皆有例外，盡管我們提供了多種 buffer 來匹配相應(yīng)的實驗，但是不得不承認(rèn)，依然有某些克隆的抗體，我們還未優(yōu)化好相應(yīng)的 buffer，比如 Ki-67 的 16A8 克隆號的抗體。不過，16A8 可以使用 70% 冰乙醇作為固定破膜劑，詳細(xì)的使用請見相應(yīng)的產(chǎn)品說明書。
3選擇合適的對照
何為陰性何為陽性？選擇合適的對照就顯得格外重要。我們的官網(wǎng)中介紹了流式實驗中的常見對照組：https://www.biolegend.com/flow_controls
同型對照-isotype control
假如您的實驗只涉及了細(xì)胞表面的染色，同型對照就是一個理想的對照組。但是在胞內(nèi)染色時，只有同型對照，還不足以準(zhǔn)確地進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。在做胞內(nèi)染色的流式實驗時，我們時常發(fā)現(xiàn)整個細(xì)胞群體都發(fā)生了漂移，這樣就會在數(shù)據(jù)分析的時候誤導(dǎo)我們，難以判斷什么才是真正的陽性細(xì)胞群體。所以在胞內(nèi)染色實驗時，isotype 只能作為一個參考，但是不能作為最終劃門的標(biāo)準(zhǔn)，尤其在那類陰陽性細(xì)胞有明顯的界限的情況下。如下圖所示，假如您是按照 isotype 的 MFI 值來劃定十字門（黑色實線），您會在 Q1 和 Q2 門里發(fā)現(xiàn)，陽性細(xì)胞的比例變高了。如果按照陰性和陽性的分界線來劃門（紅色實線），您獲得的數(shù)據(jù)就會更加準(zhǔn)確。
生物學(xué)對照
當(dāng)做胞內(nèi)細(xì)胞因子或者信號通路分子的胞內(nèi)染色時，選用生物學(xué)對照作為劃門的標(biāo)準(zhǔn)是個不錯的選擇。比如說，您的樣品細(xì)胞是 PMA/Inomycin、LPS 或者 CD3/CD28 刺激的細(xì)胞，您也應(yīng)該同時準(zhǔn)備相同類型的細(xì)胞，但是不給予相應(yīng)的刺激。這樣才能區(qū)分出刺激前后，目的蛋白的本底表達(dá)水平和接受刺激之后細(xì)胞應(yīng)答所產(chǎn)生的表達(dá)變化。
人外周血極化得到的Th2細(xì)胞僅使用monensin處理（上左圖）或使用monensin及PMA、Ionomycin處理三小時后（上右圖）使用CD3（x軸）表面染色和GM-CSF（Y軸）胞內(nèi)染色結(jié)果。
熒光減一對照（FMO）
除了以上的對照組外，還有一個重要的對照，即熒光減一對照。顧名思義，F(xiàn)MO 指的是使用的熒光為您樣品所有染色指標(biāo)減少一個指標(biāo)的對照。這一對照不僅可以幫助您界定弱表達(dá)指標(biāo)的陰陽性，還可以在多指標(biāo)的 panel 中幫您從熒光溢漏的信號中區(qū)分出陰性群和陽性群。
希望通過本文，可以幫助您理解胞內(nèi)染色實驗中的一些注意事項，比如確定合適的抗體濃度、buffer 以及合適的對照。最后，愿各位研究者能夠獲取一致并且可信的數(shù)據(jù)。
