神經(jīng)分析方案革新：無標(biāo)記自動化高通量活細胞神經(jīng)生長動力學(xué)評價

2024.9.14

體外神經(jīng)突生長分析是神經(jīng)科學(xué)研究領(lǐng)域非常重要的實驗方法，主要用于評估神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)和功能，在神經(jīng)相關(guān)疾病研究、模型建立和藥物評價領(lǐng)域應(yīng)用廣泛?，F(xiàn)有的評價方案多基于特定的神經(jīng)細胞熒光標(biāo)記，抑或由于設(shè)備限制，無法開展神經(jīng)細胞生命周期的全時程監(jiān)測。

安捷倫 BioTek 近期推出了全新神經(jīng)細胞分析軟件模塊，搭載經(jīng)典的 Cytation&BioSpa8 高通量活細胞成像平臺，可輕松幫助研究者獲得?Label Free?的神經(jīng)突生長動力學(xué)分析結(jié)果。

Cytation 成像平臺的?Label Free?技術(shù)優(yōu)勢

無標(biāo)記成像技術(shù)提供了一種在活細胞中評估神經(jīng)生長的最精簡操作方案，相較之下，由于必須證明熒光標(biāo)記物不會干擾研究中的生物過程，用于活細胞分析的熒光模型需要大量的開發(fā)和驗證投入。相反，無標(biāo)記方法能夠立即適用于各種樣本類型，包括那些不適宜進行熒光操作的樣本。此外，使用無標(biāo)記方法也可以很好的避免熒光成像可能造成的細胞毒性和光毒性效應(yīng)。

安捷倫 Cytation5&7 成像平臺具有獨特設(shè)計的無標(biāo)記成像硬件模塊，能夠提供三種不同的無標(biāo)記成像模式：無標(biāo)記明場、無標(biāo)記高對比度明場及無標(biāo)記相差成像。三種成像模式為不同的樣本類型提供高質(zhì)量的無標(biāo)記細胞圖像。本文中展示了明場及相差模式獲得神經(jīng)細胞的無標(biāo)記圖像，搭載 BioSpa8 智能培養(yǎng)箱，可自動化開展多通量的活細胞無標(biāo)記圖像采集。

圖 1：Cytation 成像系統(tǒng)的三種不同的無標(biāo)記成像模式

主要實驗流程

本文采用 iPSCs 誘導(dǎo)的皮質(zhì)神經(jīng)元（iCell GlutaNeurons）模型，細胞接種于 96 孔板后，設(shè)置總長度為 5 天的 BioSpa8 培養(yǎng)流程，其中前24小時細胞貼壁生長，隨后進行第一次 50% 培養(yǎng)基換液及給藥，培養(yǎng)至 48 小時完成第二次培養(yǎng)基換液及給藥。最后通過 BioSpa8 程序自動完成后續(xù)的神經(jīng)生長調(diào)節(jié)劑評價檢測。實驗流圖示意圖如下：

圖 2：無標(biāo)記自動化高通量活細胞神經(jīng)生長評價實驗流程

無標(biāo)記神經(jīng)細胞基礎(chǔ)生長動態(tài)評價結(jié)果

在藥物評價之前，先對神經(jīng)細胞的基礎(chǔ)生長進行準確評估。

在這個實驗方案中，初次拍攝采用 3h 拍照間隔，連續(xù)采集 120 小時，采用 Gen5 軟件識別神經(jīng)細胞的總長度用于評價神經(jīng)細胞生長情況。比較有趣的是，結(jié)果發(fā)現(xiàn)起始拍照點和三小時后的第二個時間點的神經(jīng)生長有較大的跳躍（圖3C,D），為了探究這個現(xiàn)象，前 6 個小時采用更為密集的拍攝間隔(10min)，用于獲得精準的神經(jīng)細胞生長曲線。結(jié)果顯示，在培養(yǎng)的前三個小時內(nèi)，iCell GlutaNeurons 表現(xiàn)出快速和持續(xù)的生長增加。對培養(yǎng)前 3 小時神經(jīng)突平均生長長度進行 Gen5 分析，結(jié)果顯示每個細胞的生長速率為~ 500 μm/天(圖 3F)。在早期快速生長期之后，神經(jīng)元過渡到慢速生長階段(15 μm/天，圖 3D)。

圖 3：無標(biāo)記神經(jīng)元基礎(chǔ)生長分析。A，20x 相差成像及軟件識別；B，20X 明場成像及軟件識別。C，相差及明場神經(jīng)突總長度動力學(xué)分析數(shù)據(jù)。D，24 小時 - 120 小時神經(jīng)突平均長度線性擬合用于分析平均生長速度。E，拍攝間隔 10 分鐘，總拍攝長度 6 小時的神經(jīng)突生長曲線。F，對前 3 小時的神經(jīng)突平均長度進行線性擬合用于分析神經(jīng)元生長速率。

無標(biāo)記神經(jīng)突分析用于評價藥物作用效果

神經(jīng)元生長曲線分析結(jié)果可用于幫助選擇給藥時間點，本方案中選擇神經(jīng)細胞種板后的 24-48 小時完成給藥，在 96 孔板上評價了 4 種不同的神經(jīng)生長調(diào)節(jié)劑的作用效果，包括 Blebbistatin（布比他汀）、6BIO（公藤甲素）、triptolide（雷公藤內(nèi)酯）和 Staurosporine（星形孢菌素），每種藥物設(shè)置 3 個濃度梯度。本分析方案中，能夠獲得每種藥物對神經(jīng)元突起總長度（圖 4）、平均突起長度和神經(jīng)突數(shù)量的定量結(jié)果（圖 5），并且 Gen5 的動力學(xué)曲線分析能夠獲得每種藥物的促神經(jīng)生長時間窗口、高濃度細胞抑制時間窗口、平均治療后反應(yīng)時間等參數(shù)（圖 5）。

圖 4：四種不同的神經(jīng)調(diào)節(jié)劑對 iCell GlutaNeurons 的生長作用效果的動態(tài)評價。評價指標(biāo)：神經(jīng)突總長度，成像模式：20X相差。A：Staurosporine（星形孢菌素）B：Blebbistatin（布比他?。〤：6BIO（公藤甲素）D：triptolide（雷公藤內(nèi)酯）。

圖 5：平均神經(jīng)突長度和單細胞神經(jīng)突分支數(shù)動力學(xué)分析結(jié)果用于確定每種藥物的治療反應(yīng)時間。

最后，通過在 Gen5 軟件中計算動力學(xué)成像過程最后 12 小時的神經(jīng)分析參數(shù)的平均值，可以獲得每種藥物的劑量 - 反應(yīng)曲線（圖 6），以下結(jié)果展示了總神經(jīng)突長度、平均神經(jīng)突長度、單細胞神經(jīng)突分支數(shù)三種不同評價指標(biāo)獲得的藥物劑量效應(yīng)曲線。