WB代替技術(shù)：鹿明PRM靶向蛋白組學(xué)服務(wù)

2018.12.23

如今，蛋白組學(xué)的研究大多都是利用基于質(zhì)譜的bottom-up的方法進(jìn)行研究，其中最為常見(jiàn)的是基于高效液相色譜的鳥(niǎo)槍法。

LC-MS/MS具有強(qiáng)大的蛋白定性能力，但是在定量上其靈敏度仍有待提高。近年來(lái)，基于質(zhì)譜的多重靶向蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，在蛋白精準(zhǔn)定量上的展現(xiàn)了更高的靈敏度以及良好的重現(xiàn)性。

選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)（selected reaction monitoring，SRM）是靶向蛋白組學(xué)的金標(biāo)準(zhǔn)，平行反應(yīng)監(jiān)測(cè) (Parallel reaction monitoring，PRM)是其衍生技術(shù)。

PRM技術(shù)在整個(gè)液相分離過(guò)程中會(huì)不斷地對(duì)每一個(gè)目標(biāo)母離子的全部碎片離子圖譜進(jìn)行記錄。相比于SRM只檢測(cè)目標(biāo)離子對(duì)的模式，PRM檢測(cè)所選擇的母離子窗口內(nèi)的所有碎片信息。PRM技術(shù)依賴(lài)于高分辨率的質(zhì)譜儀，需要儀器的掃描速度足夠快，以便在高效液相色譜中能夠獲得足夠多的數(shù)據(jù)點(diǎn)。

PRM主要的優(yōu)勢(shì)就是使用了超高分辨率的Orbitrap質(zhì)量分析器，其能夠?qū)⒏蓴_信息與真實(shí)的信號(hào)進(jìn)行區(qū)分，以及相比于傳統(tǒng)的SRM方法能夠更好的保證分析的選擇性。其缺點(diǎn)是能夠監(jiān)視的母離子的數(shù)量取決于Orbitrap分析器的工作循環(huán)或瞬時(shí)長(zhǎng)度以及色譜條件，不過(guò)其數(shù)量能夠通過(guò)利用time-scheduling、parallelization和降低Orbitrap的分辨率來(lái)增加。

圖1. PRM實(shí)驗(yàn)原理圖示

PRM技術(shù)的優(yōu)勢(shì)

在高通量的檢測(cè)過(guò)程中保證定量的靈敏度和特異性；
與SRM相比，不需要母離子/子離子對(duì)，僅需要母離子信息，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)更簡(jiǎn)單；
可通過(guò)二級(jí)全掃描定性定量，在復(fù)雜背景中抗干擾能力強(qiáng)，分辨率高；
可根據(jù)需求選擇加入合成的標(biāo)準(zhǔn)肽段，節(jié)約實(shí)驗(yàn)成本；
PRM技術(shù)重現(xiàn)性好，可以在多次重復(fù)檢測(cè)中保證結(jié)果的穩(wěn)定性。

PRM應(yīng)用領(lǐng)域

細(xì)菌磷酸化蛋白組學(xué)重現(xiàn)性檢測(cè)
組氨酸修飾定量檢測(cè)
大鼠酰肉堿定量檢測(cè)
更多檢測(cè)內(nèi)容請(qǐng)留言咨詢……

PRM的流程

確定待驗(yàn)證的蛋白，一般可以通過(guò)以下幾個(gè)途徑獲得：shot gun鑒定信息、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)等（客戶提供）。
選取合適的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組蛋白樣品，提取樣品中總蛋白，DDA檢測(cè)。
根據(jù)DDA搜庫(kù)結(jié)果，結(jié)合文獻(xiàn)、數(shù)據(jù)庫(kù)信息挑選可靠的靶向肽段（每個(gè)蛋白2-5個(gè)肽段）。
按照一定的比例在樣品肽段中加入內(nèi)標(biāo)iRT，進(jìn)行PRM檢測(cè)。
檢測(cè)結(jié)果分析，包括內(nèi)標(biāo)iRT質(zhì)控、樣品重復(fù)性檢驗(yàn)等。

圖2. PRM靶向定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析基本流程

送樣要求

樣品類(lèi)型	樣品要求（/組樣品）
蛋白質(zhì) 提取物	濃度?>1μg/μl（最好是4μg/μl），蛋白質(zhì)總量?>300μg
細(xì)胞樣品	細(xì)胞量>10⁷個(gè)
組織樣品	動(dòng)物組織>100mg；植物組織>200mg
體液樣品	血液體積>100μl，尿液>10ml, 唾液>1ml