外泌體蛋白質(zhì)組|ALZHEIMERS DEMENT（IF 16.655）：蛋白質(zhì)組學(xué)研究助力阿爾茲海默癥生物標(biāo)志物篩選

鹿明生物

2023.5.18

2023年4月Madhurima Chatterjee發(fā)表了題為“C1q is increased in cerebrospinal fluid-derived extracellular vesicles in Alzheimer''s disease: A multi-cohort proteomics and immuno-assay validation study”的研究成果，作者使用多隊(duì)列蛋白質(zhì)組學(xué)和免疫測(cè)定（Elisa）驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)在阿爾茲海默癥（AD）患者的腦脊液（CSF）中C1q的表達(dá)顯著增加，表明C1q蛋白的表達(dá)變化與阿爾茲海默癥的發(fā)生有關(guān)。該研究結(jié)果為未來(lái)阿爾茲海默癥的預(yù)防和治療提供了潛在新方向。

中文標(biāo)題：阿爾茲海默癥腦脊液來(lái)源的細(xì)胞外囊泡中C1q增加：一項(xiàng)多隊(duì)列蛋白質(zhì)組學(xué)和免疫驗(yàn)證研究

研究對(duì)象：腦脊液細(xì)胞外囊泡

發(fā)表期刊：Alzheimer’s & Dementia

影響因子：16.655

發(fā)表時(shí)間：2023年4月6日

發(fā)表單位：德國(guó)神經(jīng)退行性疾病中心

運(yùn)用生物技術(shù)：DIA非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組、Label Free蛋白組、ELISA

研究背景

細(xì)胞外囊泡（EV）是由所有中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞釋放的直徑為50-200nm的囊泡，包括神經(jīng)元細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞，少突膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞。EV在細(xì)胞間通訊和有毒細(xì)胞含量的釋放中起著重要作用，從而調(diào)節(jié)關(guān)鍵的細(xì)胞過(guò)程，如信號(hào)傳導(dǎo)、轉(zhuǎn)移、血管生成或炎癥。在許多神經(jīng)退行性疾病中，包括帕金森（PD）、肌萎縮側(cè)索硬化癥和阿阿爾茲海默癥（AD），EVs已被認(rèn)為有助于疾病病理的擴(kuò)散。

AD的特征是聚集的β-淀粉樣蛋白（Aβ）在腦內(nèi)的細(xì)胞外沉積，神經(jīng)原纖維纏結(jié)中過(guò)度磷酸化的tau蛋白在細(xì)胞內(nèi)聚集。許多神經(jīng)退行性疾病的病理開(kāi)始在大腦的特定區(qū)域發(fā)展，然后以特定模式緩慢擴(kuò)散到其他區(qū)域。然而，這些聚集的蛋白質(zhì)如何從大腦的一個(gè)區(qū)域傳播到另一個(gè)區(qū)域仍然是個(gè)謎。最近，許多研究表明，Aβ和tau通過(guò)EV從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞是可能的機(jī)制之一。

本研究的主要目的是確定新的CSF EV相關(guān)的生物標(biāo)志物。為了全面了解在AD中可能被改變的EV相關(guān)蛋白或途徑，并對(duì)EV在神經(jīng)退行性疾病中的作用提供新的見(jiàn)解，有必要確定神經(jīng)退行性疾病中CSF EV蛋白譜。此外，EV蛋白可以作為診斷和預(yù)測(cè)的生物標(biāo)志物，有助于臨床試驗(yàn)的患者分層。

研究思路

研究結(jié)果

? 1.?腦脊液EVs蛋白質(zhì)組學(xué)分析

采用數(shù)據(jù)非依賴性（DIA）模式對(duì)隊(duì)列1（AD=22，對(duì)照=15，哥廷根）腦脊液EVs進(jìn)行蛋白測(cè)，總共檢測(cè)到613種蛋白質(zhì)，其中50種已在ExoCarta（在線數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)，可對(duì)與蛋白質(zhì)，RNA和脂質(zhì)有關(guān)的外泌體特定數(shù)據(jù)進(jìn)行編目）前100種蛋白質(zhì)（exocarta.org）中鑒定出來(lái)（圖1 A），包括CD9、CD63和PDCD6IP（ALIX）等EV標(biāo)志物。由于ExoCarta是EV相關(guān)蛋白的最大數(shù)據(jù)庫(kù)之一，因此作者通過(guò)分析ExoCarta與超速離心法和Vn96兩種方法分離的EVs的蛋白質(zhì)組重疊來(lái)檢測(cè)EVs的質(zhì)量。

在隊(duì)列2（AD=20，對(duì)照=16，阿姆斯特丹）中，使用合成的Vn 96肽從CSF中親和捕獲EV，進(jìn)行數(shù)據(jù)依賴性采集（DDA）質(zhì)譜法對(duì)蛋白檢測(cè)，共鑒定了468種蛋白質(zhì)，其中274種蛋白質(zhì)與隊(duì)列1重疊，21種蛋白質(zhì)與ExoCarta前100種蛋白質(zhì)重疊（圖1 B）。

對(duì)隊(duì)列1和2檢測(cè)到的蛋白進(jìn)行富集分析，發(fā)現(xiàn)都富集到諸如細(xì)胞外囊泡、膜結(jié)合囊泡等條目（圖1 A）。這表明這兩種方法都可以有效地從腦脊液中分離EV，但是在蛋白質(zhì)組成和鑒定蛋白質(zhì)數(shù)量方面存在細(xì)微差異。由于親和純化可能僅代表腦脊液中存在的EV總?cè)后w的一部分，因此作者決定使用超速離心純化的EV執(zhí)行所有驗(yàn)證步驟。

圖1 | 隊(duì)列1和隊(duì)列2蛋白組學(xué)分析

通過(guò)Pearson相關(guān)性和主成分分析（PCA）對(duì)隊(duì)列1的蛋白質(zhì)豐度數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)AD患者和對(duì)照組的蛋白質(zhì)組譜存在顯著差異（圖2）。在AD患者的CSF EV樣品中，有114個(gè)蛋白質(zhì)與對(duì)照組相比有明顯的改變，其中26個(gè)蛋白質(zhì)明顯增加，88個(gè)蛋白質(zhì)明顯減少。值得注意的是，與非癡呆對(duì)照組相比，AD患者的CSF EV相關(guān)的補(bǔ)體蛋白C1q、C1r和C1s都有所增加（圖2 A）。上調(diào)蛋白GO分析顯著富集到補(bǔ)體激活的調(diào)節(jié)、免疫效應(yīng)過(guò)程的調(diào)節(jié)和體液反應(yīng)的調(diào)節(jié)（圖3 A）。下調(diào)蛋白與中性粒細(xì)胞脫顆粒和中性粒細(xì)胞激活有關(guān)（圖3 B）。

圖2 | 隊(duì)列1腦脊液蛋白分析

?圖3 | 隊(duì)列1蛋白組學(xué)富集分析

? 2.?使用 ELISA 驗(yàn)證 C1q 和其他生物標(biāo)志物

接下來(lái)，作者使用ELISA驗(yàn)證了補(bǔ)體因子C1q在AD中相對(duì)于對(duì)照組上調(diào)。此外，在AD動(dòng)物模型中，C1q對(duì)突觸的調(diào)理作用被證明有助于神經(jīng)退行性變，而在人類(lèi)AD大腦中，C1q高表達(dá)與淀粉樣斑塊相關(guān)。在隊(duì)列3中（AD=24，對(duì)照=16，波恩），AD組CSF EV C1q水平顯著高于對(duì)照組（P=0.03，圖4 A）。

由于在隊(duì)列3中發(fā)現(xiàn)C1q明顯增加，所以在一個(gè)更大的隊(duì)列，即隊(duì)列4（AD=43，對(duì)照=100，阿姆斯特丹）中驗(yàn)證了這個(gè)生物標(biāo)志物。在隊(duì)列4中，與隊(duì)列2相似，與對(duì)照組相比，AD組的CSF EV C1q水平明顯升高（圖4 C）。此外，作者還驗(yàn)證了AD CSF EVs中的下調(diào)蛋白醛縮酶C（ALDOC）)和組織蛋白酶B（CTSB），結(jié)果與組學(xué)結(jié)果一致。

?圖4 | ELISA 驗(yàn)證結(jié)果

研究結(jié)論

本研究結(jié)果揭示了C1q蛋白與阿爾茲海默癥的關(guān)聯(lián)，這可能提供一種在診斷和治療該疾病方面的潛在新路徑。此外，該研究的結(jié)果也使我們更加了解細(xì)胞外囊泡在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的潛在作用，這可能為未來(lái)相關(guān)研究提供基礎(chǔ)。

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本研究通過(guò)多隊(duì)列蛋白質(zhì)組學(xué)和Elisa驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)在阿爾茲海默癥患者的腦脊液中，C1q的表達(dá)顯著增加，這一發(fā)現(xiàn)意味著C1q可能是阿爾茲海默癥的生物標(biāo)志物，可以用于診斷、預(yù)測(cè)和治療該疾病，為解決該疾病的發(fā)病機(jī)制和治療方法提供新的線索。

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