T/CI 011-2021
細(xì)菌生物被膜的培養(yǎng)、觀測(cè)和耐藥性評(píng)測(cè)技術(shù)指南

Technical guidelines for the cultivation, observation and drug resistance evaluation of bacterial biofilm

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T/CI 011-2023

 

 

適用范圍

細(xì)菌生物被膜培養(yǎng)方法與技術(shù)標(biāo)準(zhǔn) 以下生物被膜培養(yǎng)方法與技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)均以銅綠假單胞菌為模式菌株撰寫，其他菌種培養(yǎng)以及實(shí)驗(yàn)條件可按需求適當(dāng)調(diào)整。 銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一種常見的革蘭氏陰性條件致病菌，在正常人皮膚、呼吸道、腸道以及多種自然環(huán)境如水、土壤中廣泛分布。此菌為桿狀單鞭毛形態(tài)，適宜生長(zhǎng)溫度為25-37℃，在42℃也可生長(zhǎng)，于LB培養(yǎng)基上呈青綠色圓形菌落且極易附著在不同基質(zhì)表面形成生物被膜。銅綠假單胞菌是醫(yī)院內(nèi)感染的主要致病菌之一，可在免疫力低下的患者不同部位形成生物被膜引起長(zhǎng)期慢性感染，包括燒傷傷口感染、呼吸道感染和尿路感染等，并可引發(fā)菌血癥和敗血癥等致命并發(fā)癥。此菌對(duì)多種抗生素耐藥，并且耐藥機(jī)制非常復(fù)雜，包括形成生物被膜、加強(qiáng)外排泵系統(tǒng)、改變細(xì)胞膜通透性與藥物作用靶點(diǎn)、以及分泌抗菌酶等。銅綠假單胞菌生物被膜的形成機(jī)制也相當(dāng)復(fù)雜，例如通過過量分泌胞外多糖、積累胞外DNA、降低運(yùn)動(dòng)能力、調(diào)節(jié)群體感應(yīng)系統(tǒng)等。作為研究生物被膜的模式菌株，銅綠假單胞菌早已被廣泛應(yīng)用于構(gòu)建生物被膜、檢測(cè)其耐藥性并開發(fā)用藥方案的研究中，是以本指南以銅綠假單胞菌為模式菌株撰寫，其他菌種的培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)條件可按需適當(dāng)調(diào)整以達(dá)到最佳實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 4.1 體外靜態(tài)生物被膜培養(yǎng)  本指南囊括四種常用的體外靜態(tài)生物被膜培養(yǎng)方法，包括孔板培養(yǎng)法、玻璃珠培養(yǎng)法、玻片培養(yǎng)法和Peg-lid培養(yǎng)法。 （1）孔板培養(yǎng)法（4.1.1）將稀釋菌液在96孔板或24孔板中培養(yǎng)，生物被膜附著于孔壁上，移除懸浮液并洗脫浮游菌體可得到生物被膜用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)?？装迮囵B(yǎng)法一般用于檢測(cè)菌種生物被膜形成能力、生物被膜定量、生物被膜耐藥性和藥物最小抑菌濃度等實(shí)驗(yàn)。此培養(yǎng)法可與多種染色法結(jié)合用于定量生物被膜，培養(yǎng)出的生物被膜結(jié)構(gòu)可用不同顯微鏡觀察。此培養(yǎng)法具有通量高、培養(yǎng)時(shí)間短和操作簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)，但培養(yǎng)的生物被膜厚度與硬度較低，浮游菌體不易洗脫造成平行間差異較大。 （2）玻璃珠培養(yǎng)法（4.1.2）在24孔板中將玻璃珠置于稀釋菌液內(nèi)培養(yǎng)，生物被膜附著于玻璃珠表面，洗脫浮游菌體可得到生物被膜用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。此培養(yǎng)法與孔板培養(yǎng)法類似，一般用于檢測(cè)菌種生物被膜形成能力、生物被膜定量、生物被膜耐藥性和藥物最小抑菌濃度等試驗(yàn)。此培養(yǎng)法可與多種染色法結(jié)合用于定量生物被膜，但不易在顯微鏡下觀察。此培養(yǎng)法具有通量高、培養(yǎng)時(shí)間短等優(yōu)勢(shì)，但操作略復(fù)雜。此方法培養(yǎng)的生物被膜厚度與硬度較高，浮游菌體較易清洗，平行間差異較小。 （3）玻片培養(yǎng)法（4.1.3）將玻片插入菌液培養(yǎng)，生物被膜附著于玻片表面，去除撥片并洗脫浮游菌體得到生物被膜用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。此方法一般用于檢測(cè)菌種生物被膜形成能力、觀察生物被膜結(jié)構(gòu)與形態(tài)，可與多種染色方法和多種顯微鏡結(jié)合使用觀測(cè)生物被膜構(gòu)態(tài)。此方法通量高、培養(yǎng)時(shí)間短，但操作略復(fù)雜。此方法培養(yǎng)的生物被膜量較大、厚度與硬度高，浮游菌體易清洗，平行間差異較小。 （4）Peg-lid培養(yǎng)法（4.1.4）將帶有凸起楔子（peg）的96孔板蓋置于裝有菌液的96孔板中培養(yǎng)，生物被膜附著于peg中下端，取下蓋子并洗脫peg上的浮游菌體可得到生物被膜用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。此方法與孔板培養(yǎng)法類似，一般用于檢測(cè)菌種生物被膜形成能力、生物被膜定量、生物被膜耐藥性和藥物最小抑菌濃度等試驗(yàn)。此培養(yǎng)法可與多種染色法結(jié)合用于定量生物被膜，但培養(yǎng)出的生物被膜由于在楔子頂端，不易于顯微鏡觀察。此培養(yǎng)法具有通量高、培養(yǎng)時(shí)間短和操作簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)，培養(yǎng)的生物被膜厚度與硬度較高，浮游菌體較易洗脫、平行間差異較小。 每種培養(yǎng)與觀測(cè)方法細(xì)節(jié)請(qǐng)見下文。 4.1.1 孔板培養(yǎng)法 適用范圍：孔板生物被膜培養(yǎng)法通常適用于以下場(chǎng)景：（1）需要檢測(cè)不同菌種（野生菌種和突變菌種）間生物被膜形成能力，（2）需要檢測(cè)不同菌株在生物被膜狀態(tài)下對(duì)藥物的敏感/耐受性。針對(duì)孔板培養(yǎng)的生物被膜的分析方法主要包括：生物被膜定量（章節(jié)5.1.2a）、生物被膜耐藥性和藥物最小抑菌濃度（章節(jié)6.1）。以下示意裝置和操作均以銅綠假單胞菌（PA）為模式菌株，在耗氧培養(yǎng)條件下進(jìn)行示例：   圖1. 體外靜態(tài)生物被膜培養(yǎng)方法（孔板培養(yǎng)法） 4.1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料： a. 無菌96孔板（或24孔板, Nest/Corning）； b. 無菌儲(chǔ)液器； c. 100 μL排槍移液器（或1 mL移液器）； d. 15 mL無菌搖菌管； e. 100 μL（或1 mL）移液器槍頭； f. LB培養(yǎng)基（可按需使用其他培養(yǎng)基）； g. 所需菌株； h. 廢液桶； i. 75%酒精； j. 無菌ddH2O； k. 無菌生理鹽水。 4.1.1.2 培養(yǎng)步驟【附錄以protocol/SOP模式進(jìn)行詳細(xì)闡述】 首先將目標(biāo)菌株接種至LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。在無菌操作臺(tái)中，用新鮮培養(yǎng)基將菌液按一定比例稀釋，隨后將稀釋好的菌液傾倒入無菌儲(chǔ)液器，再用排槍移液器將稀釋菌液加入96孔板或24孔板孔洞中，并置于所需溫度下靜置培養(yǎng)生物被膜。實(shí)驗(yàn)菌種和對(duì)照菌種均按照附錄Xa的培養(yǎng)步驟進(jìn)行接種、培養(yǎng)（附錄Xa），隨后對(duì)生物被膜進(jìn)行分析（章節(jié)5）。 4.1.1.3 技術(shù)要點(diǎn) a. 所有操作須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作流程，在操作過程中注意須使用滅菌器具并用酒精消毒操作臺(tái)以及所使用的器具，避免交叉污染； b. 在將菌液加入孔板前，輕輕搖晃儲(chǔ)液器將菌液混合均勻，并用排槍反復(fù)輕輕吹打菌液，以減小實(shí)驗(yàn)誤差； c. 孔板培養(yǎng)生物被膜需保證培養(yǎng)后孔洞內(nèi)剩余菌液體積基本一致，培養(yǎng)時(shí)需用透氣封口膜密封孔板防止液體蒸發(fā)； d. 移除廢液以及清洗生物被膜時(shí)須注意不可用槍頭觸碰生物被膜，以保證生物被膜完整性。 4.1.2玻璃珠培養(yǎng)法 適用范圍：玻璃珠生物被膜培養(yǎng)法通常適用于以下場(chǎng)景：（1）用于循環(huán)培養(yǎng)生物被膜進(jìn)行壓力條件進(jìn)化實(shí)驗(yàn)，（2）需要檢測(cè)不同菌株在生物被膜狀態(tài)下對(duì)藥物的敏感/耐受性。針對(duì)玻璃珠培養(yǎng)的生物被膜的分析方法主要為：CFU計(jì)數(shù)法（章節(jié)5.3.2b）。以下示意裝置和操作均以銅綠假單胞菌（PA）為模式菌株，在耗氧培養(yǎng)條件下進(jìn)行示例：   圖2. 體外靜態(tài)生物被膜培養(yǎng)方法（玻璃珠培養(yǎng)法） 4.1.2.1 實(shí)驗(yàn)材料： a. 無菌24孔板； b. 無菌儲(chǔ)液器； c. 1 mL移液器 d. 15 mL無菌搖菌管； e. 1 mL移液器槍頭； f. LB培養(yǎng)基（可按需使用其他培養(yǎng)基）； g. 無菌ddH2O（可按需使用PBS溶液或生理鹽水）； h. 所需菌株； i. 廢液桶； j. 75%酒精； k. 鑷子； l. 3-5 mm玻璃珠。 4.1.2.2 培養(yǎng)步驟【附錄以protocol/SOP模式進(jìn)行詳細(xì)闡述】 首先將目標(biāo)菌株接種至LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，用新鮮培養(yǎng)基將菌液按一定比例稀釋，隨后將稀釋好的菌液轉(zhuǎn)移至24孔板孔洞中，并加入兩顆無菌玻璃珠，37℃ 100 rpm轉(zhuǎn)速搖晃培養(yǎng)過夜。實(shí)驗(yàn)菌種和對(duì)照菌種均按照附錄Xa的培養(yǎng)步驟進(jìn)行接種、培養(yǎng)（附錄Xb），隨后對(duì)生物被膜進(jìn)行分析（章節(jié)5）。 4.1.2.3 技術(shù)要點(diǎn) a. 所有操作須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作流程，在操作過程中注意須使用滅菌器具并用酒精消毒操作臺(tái)以及所使用的器具，避免交叉污染； b. 在將菌液加入孔板前，輕輕搖晃儲(chǔ)液器將菌液混合均勻，并用移液器反復(fù)輕輕吹打菌液，以減小實(shí)驗(yàn)誤差； c. 孔洞內(nèi)菌液不可過多，以免搖晃培養(yǎng)時(shí)菌液濺出造成交叉污染； d. 用無菌鑷子轉(zhuǎn)移玻璃珠時(shí)，需盡量減少鑷子與玻璃珠接觸面，以保證生物被膜完整性； e. 孔板培養(yǎng)生物被膜需保證培養(yǎng)后孔洞內(nèi)剩余菌液體積基本一致，培養(yǎng)時(shí)需用透氣封口膜密封孔板防止液體蒸發(fā)。 4.1.3 玻片培養(yǎng)法 適用范圍：玻片生物被膜培養(yǎng)法通常適用于以下場(chǎng)景：（1）需要檢測(cè)不同菌種（野生菌種和突變菌種）間生物被膜形成能力，（2）需要檢測(cè)不同菌株在生物被膜狀態(tài)下對(duì)藥物的敏感/耐受性。針對(duì)玻片培養(yǎng)的生物被膜的分析方法主要包括：生物被膜定量（章節(jié)5.1.2c）和生物被膜耐藥性（章節(jié)5.3.2c）。以下示意裝置和操作均以銅綠假單胞菌（PA）為模式菌株，在耗氧培養(yǎng)條件下進(jìn)行示例：   圖3. 體外靜態(tài)生物被膜培養(yǎng)方法（玻片培養(yǎng)法） 4.1.3.1 實(shí)驗(yàn)材料： a. 無菌培養(yǎng)皿（靜置培養(yǎng)需準(zhǔn)備6孔板）； b. 15 mL無菌搖菌管； c. LB培養(yǎng)基（可按需使用其他培養(yǎng)基）； d. 無菌ddH2O（可按需使用PBS溶液或生理鹽水） e. 所需菌株； f. 廢液桶； g. 75%酒精； h. 鑷子； i. 載玻片。 4.1.3.2 培養(yǎng)步驟【附錄以protocol/SOP模式進(jìn)行詳細(xì)闡述】 首先將目標(biāo)菌株接種至LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，用新鮮培養(yǎng)基將菌液按一定比例稀釋，隨后將稀釋好的菌液轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿，并加入無菌載玻片，37 ℃ 100 rpm轉(zhuǎn)速搖晃培養(yǎng)過夜。實(shí)驗(yàn)菌種和對(duì)照菌種均按照附錄Xa的培養(yǎng)步驟進(jìn)行接種、培養(yǎng)（附錄Xc），隨后對(duì)生物被膜進(jìn)行分析（章節(jié)5）。 4.1.3.3 技術(shù)要點(diǎn) a. 所有操作須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作流程，在操作過程中注意須使用滅菌器具并用酒精消毒操作臺(tái)以及所使用的器具，避免交叉污染； b. 培養(yǎng)皿內(nèi)菌液不可過多，以免搖晃培養(yǎng)時(shí)菌液濺出造成污染； c. 用無菌鑷子轉(zhuǎn)移載玻片時(shí)，需盡量減少鑷子與玻璃珠接觸面，以保證生物被膜完整性； d. 搖晃培養(yǎng)時(shí)需用透氣封口膜密封培養(yǎng)皿防止液體蒸發(fā)。 4.1.4 Peg-lid 培養(yǎng)法 適用范圍：Peg-lid生物被膜培養(yǎng)法通常適用于以下場(chǎng)景：（1）需要檢測(cè)不同菌種（野生菌種和突變菌種）間生物被膜形成能力，（2）需要檢測(cè)不同菌株在生物被膜狀態(tài)下對(duì)藥物的敏感/耐受性。針對(duì)Peg-lid培養(yǎng)的生物被膜的分析方法主要包括：生物被膜定量（章節(jié)5.1.2c）和生物被膜耐藥性（章節(jié)5.3.2c）。以下示意裝置和操作均以銅綠假單胞菌（PA）為模式菌株，在耗氧培養(yǎng)條件下進(jìn)行示例：   圖4. 體外靜態(tài)生物被膜培養(yǎng)方法（peg lid培養(yǎng)法） 4.1.4.1 實(shí)驗(yàn)材料： a. 96孔板； b. Peg lid蓋子（見附錄圖三）; c. 無菌儲(chǔ)液器； d. 100 μL排槍移液器； e. 15 mL無菌搖菌管； f. 100 μL（或1 mL）移液器槍頭； g. LB培養(yǎng)基（可按需使用其他培養(yǎng)基）； h. 所需菌株； i. 廢液桶； j. 75%酒精； k. 無菌ddH2O（可按需使用PBS溶液或生理鹽水）； l. 無菌生理鹽水。 4.1.4.2 培養(yǎng)步驟【附錄以protocol/SOP模式進(jìn)行詳細(xì)闡述】 首先將目標(biāo)菌株接種至LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，用新鮮培養(yǎng)基將菌液按一定比例稀釋，隨后將稀釋好的菌液轉(zhuǎn)移至96孔板中，再將peg lid小心蓋入菌液中。37℃ 100 rpm轉(zhuǎn)速搖晃培養(yǎng)過夜。實(shí)驗(yàn)菌種和對(duì)照菌種均按照附錄Xa的培養(yǎng)步驟進(jìn)行接種、培養(yǎng)（附錄Xd），隨后對(duì)生物被膜進(jìn)行分析（章節(jié)5）。 4.1.4.3 技術(shù)要點(diǎn) a. 所有操作須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作流程，在操作過程中注意須使用滅菌器具并用酒精消毒操作臺(tái)以及所使用的器具，避免交叉污染； b. 在將菌液加入孔板前，輕輕搖晃儲(chǔ)液器將菌液混合均勻，并用排槍反復(fù)輕輕吹打菌液，以減小實(shí)驗(yàn)誤差； c. 孔洞內(nèi)菌液不可過多，以免置入peg lid或震蕩培養(yǎng)時(shí)菌液濺出造成污染； d. 需保證培養(yǎng)后孔洞內(nèi)剩余菌液體積基本一致，培養(yǎng)時(shí)需用透氣封口膜密封孔板防止液體蒸發(fā)； e. 移除廢液以及清洗生物被膜時(shí)須注意不可觸碰生物被膜，以保證生物被膜完整性。 4.2 體外動(dòng)態(tài)生物被膜培養(yǎng)  本指南囊括兩種常用的體外靜態(tài)生物被膜培養(yǎng)方法，包括管式培養(yǎng)法和池式培養(yǎng)法，詳細(xì)介紹如下： （1）管式培養(yǎng)法將菌液注入硅膠管內(nèi)靜置附著后，將培養(yǎng)基以勻速注入硅膠管，流動(dòng)培養(yǎng)生物被膜，生物被膜附著于管壁上。此方法一般應(yīng)用于對(duì)生物被膜樣品需求量大的實(shí)驗(yàn)，如生物被膜樣品收集，胞外多糖收集生物轉(zhuǎn)化（biotransformation）等。此方法可形成大量生物被膜，生物被膜結(jié)構(gòu)厚，通量較高，但培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，操作較復(fù)雜，并不易用顯微鏡觀察生物被膜結(jié)構(gòu)。 （2）池式培養(yǎng)法將菌液注入培養(yǎng)池通道內(nèi)，翻轉(zhuǎn)靜置待細(xì)菌附著與蓋子上之后，將培養(yǎng)基以勻速注入培養(yǎng)通道，流動(dòng)培養(yǎng)生物被膜，生物被膜附著于三通道池蓋上。此方法一般應(yīng)用于生物被膜形態(tài)觀察、藥物對(duì)生物被膜形態(tài)的影響等實(shí)驗(yàn)，此方法形成生物被膜形態(tài)與結(jié)構(gòu)完整，可結(jié)合有熒光標(biāo)記的菌株或不同染色法，直接在顯微鏡下觀測(cè)生物被膜形態(tài)與結(jié)構(gòu)，但通量較低，操作復(fù)雜，培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)。 4.2.1 管式培養(yǎng)法（tubing-biofilm） 適用范圍：管式生物被膜培養(yǎng)法通常適用于以下場(chǎng)景：（1）需要模擬管道內(nèi)生物被膜生長(zhǎng)環(huán)境的研究，（2）需要相對(duì)大量生物被膜樣品的研究，（3）生物被膜對(duì)藥物/化合物代謝（biotransformation）的相關(guān)研究等。針對(duì)管式培養(yǎng)的生物被膜的分析方法主要包括：干重/濕重分析（章節(jié)5.4）、基因組/轉(zhuǎn)錄組/蛋白組提取和測(cè)序分析、電子顯微鏡觀察（章節(jié)5.7）、氧氣探針/化合物探針監(jiān)測(cè)等。以下示意裝置和操作均以銅綠假單胞菌（PA）為模式菌株，在耗氧培養(yǎng)條件下進(jìn)行示例： 管式生物被膜培養(yǎng)法具有較高通量，可以一次性培養(yǎng)多通道生物被膜樣品；該方法能夠一次性產(chǎn)出大量生物被膜樣品，常用于干重/濕重分析、基因樣本提取，EPS等代謝產(chǎn)物提取、電子顯微鏡觀察和氧氣探針/化學(xué)探針觀察等。   圖5. 體外動(dòng)態(tài)生物被膜培養(yǎng)方法（管式培養(yǎng)法） 4.2.1.1實(shí)驗(yàn)材料： a. 15 mL無菌搖菌管； b. 長(zhǎng)50 cm，內(nèi)直徑1.0 mm 硅膠管（潤(rùn)澤）； c. 長(zhǎng)2520 cm，內(nèi)直徑 1.0 mm 硅膠泵管（潤(rùn)澤）； d. 長(zhǎng)15 cm，內(nèi)直徑1.0 mm 硅膠管（潤(rùn)澤）； e. 長(zhǎng)10 cm，內(nèi)直徑3.2 mm 硅膠管（潤(rùn)澤）；  f. 長(zhǎng)30 cm，內(nèi)直徑 1.0 mm 硅膠泵管（潤(rùn)澤）； g. 等徑直通接頭（潤(rùn)澤）； h. 變徑直通接頭（潤(rùn)澤）； i. 魯爾接頭（潤(rùn)澤）； j. 2個(gè)2L玻璃培養(yǎng)瓶； k. 10% LB培養(yǎng)基（可按需使用其他培養(yǎng)基）； l. 過濾器（過濾孔0.22 μm）； m. 蠕動(dòng)泵（aperistaltic pump，MasterFlex）； n. 所需菌株； o. 醫(yī)用尖銳物處理容器； p. 75%酒精； q. 鑷子； r. 5 mL及1 mL無菌針管； s. 無菌針頭； t. 移液器； u. 無菌移液管。 4.2.1.2培養(yǎng)步驟【附錄以protocol/SOP模式進(jìn)行詳細(xì)闡述】 首先將裝有培養(yǎng)基的玻璃培養(yǎng)瓶、硅膠管、除泡器和鑷子在121℃高溫高壓滅菌15分鐘，取出并將硅膠管、除泡器和鑷子干燥備用。如圖一所示，在無菌操作臺(tái)中按順序用安裝雙向接頭的硅膠管b連接裝有培養(yǎng)基的玻璃培養(yǎng)瓶、無阻泵、過濾器、硅膠管c、d、e、f，2L廢液罐，同個(gè)裝置內(nèi)至少三個(gè)平行（圖內(nèi)展示一個(gè)平行），將整個(gè)系統(tǒng)置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)。 將目標(biāo)菌株接種至適當(dāng)體積的LB培養(yǎng)基中，在所需溫度下200 rpm搖晃培養(yǎng)過夜。在無菌操作臺(tái)中，用新鮮LB培養(yǎng)基將菌液稀釋至OD600nm=0.1，用無菌針管吸入2 mL稀釋菌液，并將稀釋菌液分別注入硅膠管b平行裝置中，用硅膠封口后靜置培養(yǎng)2小時(shí)使細(xì)菌細(xì)胞粘附于管壁, 用10% LB流動(dòng)培養(yǎng)基培養(yǎng)3至7天，建立生物被膜。 首先將生物被膜管式培養(yǎng)裝置進(jìn)行滅菌和組裝，在用藥組的培養(yǎng)基玻璃瓶中加入工作濃度的目標(biāo)抗生素并混合均勻；在陽(yáng)性對(duì)照組的培養(yǎng)基玻璃瓶中加入已知具有抑菌抑生物被膜濃度的粘菌素colistin并混合均勻；在陰性對(duì)照組的培養(yǎng)基玻璃瓶中加入等體積的用藥組抗生素的溶劑并混合均勻。用藥組、陽(yáng)性對(duì)照組和陰性對(duì)照組均按照附錄X的培養(yǎng)步驟進(jìn)行接種、培養(yǎng)（附錄Xe），后收集生物被膜進(jìn)行觀察。 4.2.1.3技術(shù)要點(diǎn) a. 所有操作須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作流程，在操作過程中注意須使用滅菌器具并用酒精消毒操作臺(tái)以及所使用的器具，避免交叉污染; b. 使用針管與針頭吸取菌液后，針頭不可朝向操作人，不可蓋回針頭蓋子，以免誤傷操作人員； c. 將使用過的針管與針頭丟棄入醫(yī)用尖銳物處理容器統(tǒng)一處理，避免誤傷操作人員； d. 保證無阻泵運(yùn)行速度一致，避免液體回流造成污染； e. 保證硅膠管管壁厚度適宜，造成管壁破裂，影響生物被膜形成； f. 在培養(yǎng)過程中如需添加培養(yǎng)基，須用酒精消毒瓶口與鄰近裝置表面，避免污染； g. 培養(yǎng)瓶口須用透氣封口膜密封防止培養(yǎng)基蒸發(fā)。 4.2.2 池式培養(yǎng)法（flow-cell biofilm） 適用范圍：池式生物被膜培養(yǎng)法通常適用于以下場(chǎng)景：（1）需要實(shí)時(shí)觀察生物被膜形態(tài)的相關(guān)研究，（2）需要實(shí)時(shí)觀察生物被膜中標(biāo)記蛋白/基因表達(dá)及分布的相關(guān)研究，（3）需要實(shí)時(shí)觀察生物被膜群落中不同菌種相對(duì)位置關(guān)系的研究等。針對(duì)池式培養(yǎng)的生物被膜的分析方法主要包括：死活菌細(xì)胞染色法（章節(jié)5.2）、激光共聚焦熒光顯微鏡觀測(cè)法（章節(jié)5.6）、3D熒光成像定性定量法（章節(jié)5.5）等。以下示意裝置和操作均以銅綠假單胞菌（PA）為模式菌株，在耗氧培養(yǎng)條件下進(jìn)行示例：池式生物被膜培養(yǎng)法通常適用于以下場(chǎng)景：（1）   圖6. 體外動(dòng)態(tài)生物被膜培養(yǎng)方法（池式培養(yǎng)法） 4.2.2.1　實(shí)驗(yàn)材料： a. 15 mL無菌搖菌管； b. 三通道培養(yǎng)池（3-channel flow-cell）與樹脂蓋； c. 蓋玻片； d. 硅膠膠水; e. 長(zhǎng)50 cm，內(nèi)直徑1.0 mm硅膠管； f. 長(zhǎng)25 cm長(zhǎng)20 cm，內(nèi)直徑 1.0 mm硅膠泵管，雙端安裝； g. 長(zhǎng)15 cm，內(nèi)直徑1.0 mm硅膠管； h. 長(zhǎng)30 cm，內(nèi)直徑1.0 mm硅膠泵管； i. 等徑直通接頭； j. 魯爾接頭； k. 2個(gè)2 L玻璃培養(yǎng)瓶； l. 10% LB培養(yǎng)基（可按需使用其他培養(yǎng)基）； m. 過濾器（過濾孔0.22 μm）； n. 蠕動(dòng)泵（aperistaltic pump）； o. 所需菌株； p. 醫(yī)用尖銳物處理容器； q. 75%酒精； r. 鑷子； s. 5 mL及1 mL無菌針管； t. 無菌針頭； u. 移液器； v. 無菌移液管。 4.2.2.2 培養(yǎng)步驟【附錄以protocol/SOP模式進(jìn)行詳細(xì)闡述】 首先將生物被膜池式培養(yǎng)裝置進(jìn)行滅菌和組裝，在用藥組的培養(yǎng)基玻璃瓶中加入工作濃度的目標(biāo)抗生素并混合均勻；在陽(yáng)性對(duì)照組的培養(yǎng)基玻璃瓶中加入已知具有抑菌抑生物被膜濃度的粘菌素colistin并混合均勻；在陰性對(duì)照組的培養(yǎng)基玻璃瓶中加入等體積的用藥組抗生素的溶劑并混合均勻。用藥組、陽(yáng)性對(duì)照組和陰性對(duì)照組均按照附錄X的培養(yǎng)步驟進(jìn)行接種、培養(yǎng)（附錄Xf），后收集生物被膜進(jìn)行觀察。 4.2.2.3 技術(shù)要點(diǎn) a. 所有操作須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作流程，在操作過程中注意須使用滅菌器具并用酒精消毒操作臺(tái)以及所使用的器具，避免交叉污染; b. 使用針管與針頭吸取菌液后，針頭不可朝向操作人，不可蓋回針頭蓋子，以免誤傷操作人員； c. 將使用過的針管與針頭丟棄入醫(yī)用尖銳物處理容器統(tǒng)一處理，避免誤傷操作人員； d. 保證無阻泵運(yùn)行速度一致，避免液體回流造成污染； e. 保證培養(yǎng)池翻轉(zhuǎn)狀態(tài)，以免影響生物被膜形成； f. 黏結(jié)培養(yǎng)池與池蓋時(shí)須小心不可將池蓋壓破，并須保證培養(yǎng)池與池蓋完全密封，避免菌液與培養(yǎng)基溢出造成污染； g. 保證培養(yǎng)池所有通道暢通，避免堵塞造成液體回流與污染； h. 在培養(yǎng)過程中如需添加培養(yǎng)基，須用酒精消毒瓶口與鄰近裝置表面，避免污染； i. 培養(yǎng)瓶口須用透氣封口膜密封防止培養(yǎng)基蒸發(fā)。

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