實(shí)驗(yàn)室分析方法--正相液相色譜法原理及發(fā)展
正相液相色譜(NPLC)是最常用的HPLC分離方法之ー。與RPLC相反,其固定相極性大于流動(dòng)相,樣品的保留值隨流動(dòng)相極性降低而增加。NPLC常用于分離中性和離子樣品。
一、原理與色譜柱推薦
正相液相色譜為典型的液-固吸附色譜。溶質(zhì)在柱中固定相上反復(fù)進(jìn)行吸附-解吸過程,根據(jù)不同被測物在吸附劑上吸附作用的強(qiáng)弱進(jìn)行分離。其分離機(jī)理如圖1所示。
圖1 正相色譜機(jī)理
溶質(zhì)和固定相間的吸附作用包括:①溶質(zhì)和溶劑分子對吸附劑表面特定位置的竟?fàn)幾饔?這使得溶劑組成的改變往往會(huì)引起分離情況發(fā)生很大變化;②溶質(zhì)所帶官能團(tuán)與吸附劑表面相應(yīng)的活性中心之間的相互作用,這種作用與溶質(zhì)分子的幾何形狀有關(guān),當(dāng)官能團(tuán)的位置與吸附中心匹配時(shí),保留較強(qiáng);反之,則保留較弱。
溶質(zhì)所帶官能團(tuán)的性質(zhì)是決定其吸附作用的主要因素,若溶質(zhì)分子所帶官能團(tuán)的極性強(qiáng)、數(shù)目多,則保留也強(qiáng)。不同異構(gòu)體的相對吸附作用常有較大差異,因而,正相色譜法分離異構(gòu)體比其他色譜法更為優(yōu)越。
固定相一般采用硅膠、氧化鋁和極性基團(tuán)鍵合的硅膠等。硅膠是最常用的正相色譜固定相,已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于環(huán)境樣品、石油化工樣品的分析方法建立。由于在高pH值時(shí)硅膠能夠溶解,要獲得滿意的使用壽命,不應(yīng)在pH=8以上使用某些硅膠基質(zhì)的色譜柱。此外,硅膠基質(zhì)表面的酸性使其不適宜分離堿性化合物。
Al2O3作為正相色譜固定相對不飽和化合物特別是芳香族化合物、多核芳烴有較強(qiáng)的保留能力,可以將芳烴異構(gòu)體良好分離;此外,當(dāng)樣品為堿性化合物時(shí),若使用硅膠則會(huì)造成嚴(yán)重吸附,溶質(zhì)峰拖尾或難以洗脫,此時(shí)宜選用Al2O3進(jìn)行分離。
極性鍵合相一般指鍵合有機(jī)分子中含有某種極性基團(tuán),與硅膠相比,這種極性鍵合相表面上能量分布相對均勻,因而吸附活性也比一般的硅膠低。最常用的有氰基(一CN)、醇基(Diol)、氨基(一NH2)等。極性鍵合相的極性通常弱于硅膠,所以更適于對中等物質(zhì)的分離。
氨基鍵合相固定相的吸附過程與SiO2相似但又有所不同,如圖2所Si—OH呈酸性,而ーNH2呈堿性,所以用于正相沖洗時(shí)表現(xiàn)有不同的選擇性。一NH2具有強(qiáng)的氫會(huì)能力,對某些多官能團(tuán)化合物,如甾體、強(qiáng)心等有較強(qiáng)的分離能力。在酸性介質(zhì)中,這種鍵合相作為一種離子交換劑,可用于分離酚、羧酸、核苷酸等。氨基可與糖類分子中的羥基發(fā)生選擇性相互作用,因而用乙腈—水做流動(dòng)相時(shí)可以分離單、雙和多糖,這已成為一種策類分析的常規(guī)方法。此時(shí)盡管從流動(dòng)相角度看為反相,但從機(jī)理上講為正相色譜,因?yàn)榱鲃?dòng)相中水含量的增加使溶質(zhì)的保留值降低。
氰基鍵合相的分離選擇性與硅膠相似,但因極性比硅膠弱,所以在相同流動(dòng)相條件下的保留值較硅膠小;或者若要維持相似的保留值,可用極性更小的流動(dòng)相沖洗。氰基鍵合相與某些含有雙鍵的化合物發(fā)生選擇性相互作用,因而對雙鍵異構(gòu)體或含有不等量雙鍵數(shù)的環(huán)化合物有更好的分離能力。
二醇基鍵合相是縮甘油氧丙基硅烷鍵合相的水解產(chǎn)物[Si(CH2)3OCH2CH(OH)CH2OH]對有機(jī)酸和某些低聚物可獲得好的分離。二醇基的另一個(gè)用途是可進(jìn)行某些蛋白質(zhì)的水系體積排阻色譜分離。
二、流動(dòng)相
在正相液相色譜中,由于固定相的極性大于流動(dòng)相的極性,所以增加流動(dòng)相的極性,洗脫能力増加,樣品的保留值降低。一般地,應(yīng)選擇極性適當(dāng)溶劑,使樣品的1<k'<10。
正相液相色譜以非極性或弱極性溶劑為流動(dòng)相,溶質(zhì)與流動(dòng)相的相互作用較弱,通常是在飽和烷烴(如正己烷)中加入一種極性較大的溶劑(如異丙醚)作為極性調(diào)節(jié)劑構(gòu)成的混合溶劑。混合溶劑系統(tǒng)的溶劑強(qiáng)度可隨其組成連續(xù)變化,易于找出具有適宜溶劑強(qiáng)度的溶劑系統(tǒng)。混合溶劑也可以保持溶劑的低黏度,以降低柱壓和提高柱效,以及提高選擇性,改善分離。調(diào)節(jié)極性調(diào)節(jié)劑的種類和濃度可以改變?nèi)軇┑膹?qiáng)度從而改變分離選擇性。對于難以達(dá)到所需要分離選擇性的情況,還可以考慮使用三元或四元溶劑體系。
正相色譜一般為吸附色譜,常用的溶劑可按其對固定相的吸附強(qiáng)度進(jìn)行分類,通常以溶劑強(qiáng)度參數(shù)ε0值作為衡量溶劑強(qiáng)度的指標(biāo)。ε0被定義為:
式中,E為吸附能;A為吸附劑的表面積。顯然,ε0表示溶劑分子在單位吸附劑表面上的吸附自由能,ε0越大,固定相對溶劑的吸附能力越強(qiáng),則溶質(zhì)的k'值越小,即溶劑的洗能力越強(qiáng)。表1列出了正相色譜中以硅膠為吸附劑時(shí)常用溶劑的溶劑強(qiáng)度參數(shù)。
正相色譜中溶質(zhì)分子的k'值隨溶劑ε0值的增加而下降,因此溶劑洗脫能力順序可用于尋找最佳的溶劑強(qiáng)度。表2列出了正相色譜中以硅膠為吸附劑時(shí)一些二元流動(dòng)相的洗脫能力順序。
表1 常用溶劑的洗脫能力
溶劑 | 溶劑強(qiáng)度ε0 | 溶劑 | 溶劑強(qiáng)度ε0 |
正己烷 | 0.00 | 乙酸乙酯 | 0.38 |
異辛烷 | 0.01 | 二噁烷 | 0.49 |
四氯化碳 | 0.11 | 乙腈 | 0.50 |
四氯丙烷 | 0.22 | 異丙醇 | 0.63 |
氟仿 | 0.26 | 甲醇 | 0.73 |
二氯甲烷 | 0.32 | 水 | 20.73 |
四氫呋喃 | 0.35 | 醋酸 | 20.73 |
乙醚 | 0.38 |
表2 硅膠柱上液—固色譜洗脫劑的溶劑序列
ε0 | Ⅰ | Ⅱ | Ⅲ |
0.00 | 戊烷 | 戊烷 | 戊烷 |
0.05 | 42%氯化異丙烷—戊烷 | 3%二氯甲烷—戊烷 | 4%苯—戊烷 |
0.10 | 10%氯化異丙烷—戊烷 | 7%二氯甲烷—戊烷 | 11%苯—戊烷 |
0.15 | 21%氯化異丙烷—戊烷 | 14%二氯甲烷—戊烷 | 26%苯—戊烷 |
0.20 | 4%乙醚—戊烷 | 26%二氯甲烷—戊烷 | 4%乙酸乙酯—戊烷 |
0.25 | 11%乙醚—戊烷 | 50%二氯甲烷—戊烷 | 11%乙酸乙酯—戊烷 |
0.30 | 23%乙醚—戊烷 | 82%二氯甲烷—戊烷 | 23%乙酸乙酯—戊烷 |
0.35 | 56%乙醚—戊烷 | 3%乙腈—苯 | 56%乙酸乙酯—戊烷 |
0.40 | 2%甲醇—乙醚 | 11%乙腈—苯 | |
0.45 | 4%甲醇—乙醚 | 31%乙腈—苯 | |
0.50 | 8%甲醇—乙醚 | 乙腈 | |
0.55 | 20%甲醇—乙醚 | ||
0.60 | 50%甲醇—乙醚 |
在實(shí)際分離中,正相液相色譜的分離選擇性不僅取決于°,還受溶質(zhì)與溶劑分子間的氫鍵作用等其他相互作用影響。預(yù)測α值隨溶劑組成的變化時(shí),應(yīng)遵循以下規(guī)則:
①當(dāng)強(qiáng)溶劑濃度很大或很小時(shí),一般會(huì)得到較大的α值;
②含醇的溶劑系統(tǒng)常常會(huì)得到與其他溶劑系統(tǒng)不同的α值
③含強(qiáng)堿性或非堿性強(qiáng)溶劑組分的溶劑系統(tǒng)可能達(dá)到較大的α值
三、方法發(fā)展
正相液相色譜方法建立的一般模式與反相液相色譜類似。正相液相色譜的色譜柱選擇范圍較寬,氰基柱通常是首選;與氰基柱相比,硅膠柱可獲得更大的值,適合于異構(gòu)體和疏水性溶質(zhì)的分離,但分析時(shí)必須嚴(yán)格控制流動(dòng)相中水含量,也不適于梯度分離:二醇基柱和氨基柱穩(wěn)定性較差,僅在其他類型正相色譜柱無法完成分離時(shí)采用;氧化鋁柱具有獨(dú)特的分離選擇性,但有柱效低、保留值不定、回收率低等缺點(diǎn),很少使用。
一般來說,柱尺寸為0.46cm×25μm×5μm,初始流速設(shè)為2ml/min,柱溫為35℃或室溫,初始進(jìn)樣量較大,但不應(yīng)超過50μl或50μg。
正相液相色譜流動(dòng)相首選是正己烷和丙醇組成的混合溶劑,正已烷-丙醇不僅在低紫外波長區(qū)吸收較弱,還可提供較寬的溶劑強(qiáng)度范圍,適于分離極性差異較大的樣品。除正己烷外,溶解性較好的1,1,2—三氟三氯乙烷(FC113)也可作為混合溶劑中的A溶劑,由于在低波長吸收較強(qiáng),只能用于235m以上的檢測,并且其對臭氧的破壞作用也限制了其使用。除丙醇外,B溶劑還可采用二氯甲烷、甲基叔丁醚、乙酸乙酯、乙腈等,其中丙醇適于低波長檢測(<215m)條件下強(qiáng)極性樣品的分離:二氯甲烷是高波長(>235nm)檢測條件下的B溶劑首選,但洗脫強(qiáng)度較低:甲基叔丁醚和乙酸乙酯可在225nm以上波長使用,其加入可改變?chǔ)林?乙腈也可改變樣品的α值,并在195mm以上波長范圍均無明顯紫外吸收,但是與正己烷的混溶性較差,需要另外加入共溶劑才可使用。
與反相液相色譜方法優(yōu)化過程相似,可采用0~100%丙醇-正己烷初始梯度在氰基柱上進(jìn)行初始條件分離,根據(jù)結(jié)果調(diào)整梯度程序或估算等度分離條件。為了調(diào)節(jié)分離選擇性,可調(diào)節(jié)B%或采用兩種B溶劑,但流動(dòng)相中通常不應(yīng)超過三種溶劑。當(dāng)僅改變流動(dòng)相組成效果不明顯時(shí),可改變柱類型以獲得更好的分離效果。
在正相液相色譜柱上,流動(dòng)相中的極性溶劑與固定相相互作用較強(qiáng),調(diào)整流動(dòng)相比例時(shí)需要更長的平衡時(shí)間(至少20倍柱體積)。
水是強(qiáng)極性溶劑,與硅膠或氧化鋁鍵合相當(dāng)牢固,流動(dòng)相中含有的微量水分會(huì)被固定相從流動(dòng)相中萃取出來,導(dǎo)致保留時(shí)間下降。流動(dòng)相中水分受到空氣濕度影響,難以保證流動(dòng)相的含水量固定不變,因此,采用硅膠柱時(shí),通常會(huì)用一定量的水平衡流動(dòng)相,保證含水量穩(wěn)定。
