抗體純化工藝開發(fā)平臺(tái)策略-親和層析篇
介紹
在抗體藥物純化工藝中，通常采用經(jīng)典的三步或兩步層析法，蛋白A（Protein A）親和介質(zhì)（填料）因其配基上有多個(gè)區(qū)域?qū)贵wFc片段具有特異性吸附能力，因此廣泛用于抗體捕獲步驟（第一步層析）。通過一步親和工藝，可去除細(xì)胞培養(yǎng)澄清液中大部分的雜質(zhì)，純度可達(dá)95％以上。然而，蛋白A親和層析填料較昂貴，可占抗體藥物下游純化工藝中層析填料成本的80％以上。因此，親和層析工藝的選擇不僅需要關(guān)注產(chǎn)品質(zhì)量，還要從成本角度考慮到最終產(chǎn)品的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。
隨著純化技術(shù)的發(fā)展，Protein A層析填料在不斷的改進(jìn)，目前用于抗體捕獲的重組Protein A可以與瓊脂糖微球等填料基質(zhì)進(jìn)行多點(diǎn)偶聯(lián)，進(jìn)而減少了使用過程中配基脫落的現(xiàn)象，影響層析結(jié)果。此外，為滿足生物制藥工藝清潔及消毒的要求，Protein A層析填料一般可以耐受0.1-0.5M氫氧化鈉的處理。需要注意的是，不同廠家的Protein A親和層析填料在耐堿性、結(jié)構(gòu)序列、填料基質(zhì)偶聯(lián)方式、結(jié)合載量以及配基脫落率等方面存在較大差異，因此在選擇Protein A親和層析填料時(shí)一定要系統(tǒng)考量，通過科學(xué)的實(shí)驗(yàn)對(duì)淋洗條件、洗脫方式和保留時(shí)間等步驟進(jìn)行詳細(xì)的工藝開發(fā)，在保證產(chǎn)品質(zhì)量的同時(shí)，盡可能降低相關(guān)成本。親和層析原理見圖1。
圖1. 親和層析原理圖
親和層析
親和層析工藝主要由5個(gè)部分組成：
1. 平衡：用平衡液對(duì)層析填料進(jìn)行平衡，達(dá)到最佳結(jié)合狀態(tài)；
2. 上樣：讓目的蛋白充分的與填料接觸，達(dá)到良好的吸附效果；
3. 淋洗：用淋洗液沖洗掉非特異性結(jié)合的雜質(zhì)；
4. 洗脫：將結(jié)合的目的蛋白從層析填料上洗脫，達(dá)到分離純化的效果；
5. 清洗：對(duì)使用完的層析填料進(jìn)行再生及消毒。
常規(guī)抗體親和層析工藝流程見圖2。
圖2. 親和層析工藝步驟
在親和層析工藝開發(fā)階段，平衡步驟已經(jīng)趨于平臺(tái)化，各公司均有平臺(tái)緩沖液及相關(guān)的方法可以達(dá)到良好的平衡效果，在清洗步驟上，可以根據(jù)廠家推薦的清洗方式進(jìn)行填料的再生及消毒，基本不需要進(jìn)行相關(guān)的工藝開發(fā)工作。但是在上樣、淋洗及洗脫階段，由于不同蛋白在不同的填料上層析表現(xiàn)及產(chǎn)品質(zhì)量會(huì)有較大的差異，因此需要進(jìn)行詳盡的載量測(cè)試實(shí)驗(yàn)、淋洗工藝的優(yōu)化及洗脫工藝的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，以獲得最終的親和層析工藝，開發(fā)策略見表1。
表1. 抗體類藥物親和層析工藝開發(fā)平臺(tái)策略
動(dòng)態(tài)結(jié)合載量（DBC）測(cè)試
Protein A親和層析為結(jié)合-洗脫模式，蛋白分子在層析柱里的保留時(shí)間對(duì)結(jié)合載量具有顯著的影響。推薦考察6 min保留時(shí)間條件下，填料對(duì)目的分子的結(jié)合能力。在上樣過程中，取不同點(diǎn)的流穿液檢測(cè)Titer，并繪制流穿曲線，以確定填料的動(dòng)態(tài)結(jié)合載量，然后以動(dòng)態(tài)結(jié)合載量的80%作為安全限度，確定最終的載量范圍，推薦實(shí)驗(yàn)方案如表2：
表2. 親和層析填料DBC測(cè)試實(shí)驗(yàn)方案
圖3. 親和層析DBC測(cè)試目的蛋白流穿圖（舉例）
親和層析淋洗條件優(yōu)化
親和層析上樣結(jié)束后，在洗脫之前一般會(huì)加入淋洗步驟，目的是去除非特異性結(jié)合的雜質(zhì)如HCP和HCD等。經(jīng)典的沖洗方式為高鹽溶液淋洗（0.5-1.0M NaCl）及弱酸性溶液淋洗(pH5.0-6.0)。在工藝開發(fā)過程中，可以考慮組合不同的淋洗方式，考察其對(duì)雜質(zhì)的去除效果，對(duì)沖洗條件進(jìn)行篩選，推薦實(shí)驗(yàn)方案如表3。實(shí)驗(yàn)完成后，親和層析收集樣品檢測(cè)SEC純度、HCP及HCD殘留，計(jì)算收率，選擇最佳的淋洗工藝。特別提醒，淋洗工藝的選擇可能會(huì)對(duì)整個(gè)親和層析步驟在病毒去除的效果上產(chǎn)生較大影響，同時(shí)，也可能會(huì)對(duì)填料的使用壽命具有一定影響，因此淋洗工藝的開發(fā)不可忽視。
表3. 親和層析淋洗條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方案
親和層析洗脫條件優(yōu)化
Protein A和抗體Fc段的結(jié)合主要以His殘基之間的靜電作用為主，因此，Protein A親和層析通常采用降低緩沖液pH的方式進(jìn)行洗脫，當(dāng)洗脫pH降低至4.5以下時(shí)，His殘基帶正電荷，抗體上His殘基與Protein A上的His殘基產(chǎn)生靜電排斥作用，抗體從Protein A上解離。有研究表明，洗脫階段不同的緩沖液類型會(huì)對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量和層析收率有明顯影響，因此親和層析洗脫階段的優(yōu)化，通常需要先對(duì)緩沖體系進(jìn)行篩選，推薦實(shí)驗(yàn)方案見表4。
表4. 親和層析洗脫緩沖液篩選實(shí)驗(yàn)方案
除緩沖體系外，針對(duì)不同的親和填料，不同的洗脫pH也會(huì)影響蛋白與Protein A的解離效果，對(duì)工藝的收率產(chǎn)生影響，并且對(duì)收集產(chǎn)品中的雜質(zhì)（聚體、片段等）和殘留（HCP、HCD和Protein A等）水平也有較大影響。因此，需要對(duì)洗脫pH進(jìn)行研究，樣品檢測(cè)SEC純度、 nrCE純度及殘留，并計(jì)算收率，篩選出符合預(yù)期的洗脫條件，推薦實(shí)驗(yàn)方案見表5。
表5. 親和層析洗脫pH優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方案
親和填料清洗條件優(yōu)化
Protein A層析填料通?？梢允褂酶邼舛鹊碾x液劑進(jìn)行再生，比如6M尿素和6M鹽酸胍等，但是由于這些試劑使用成本較高，一般不推薦使用。在早期的工藝開發(fā)階段可以使用廠商推薦的方案進(jìn)行填料的清洗和再生。目前比較常見的方法為弱酸/氫氧化鈉的組合進(jìn)行清洗，比如1M醋酸加0.1-0.5M氫氧化鈉。針對(duì)不同的親和填料，由于Protein A本身的耐堿性能差異較大，因此氫氧化鈉的濃度需要謹(jǐn)慎選擇。如果項(xiàng)目進(jìn)行至晚期研究階段，在進(jìn)行填料壽命研究之前，建議對(duì)填料的清洗方法進(jìn)行詳細(xì)的開發(fā)，以便最大限度的延長(zhǎng)使用壽命。
病毒去除
Protein A親和層析除了對(duì)HCP和HCD等雜質(zhì)具有良好的去除效果，同時(shí)對(duì)一些病毒的去除也有不錯(cuò)的效果，如對(duì)異嗜鼠白血病病毒（X-MuLV）的去除率（LRV）通常在1.0-3.5范圍內(nèi)，對(duì)鼠細(xì)小病毒（MVM）的去除率（LRV）在0.0–3.0范圍內(nèi)。具體的LRV值與親和層析本身的工藝條件息息相關(guān)，這可能是由于病毒與填料的非特異性結(jié)合或病毒與被捕獲的蛋白分子之間的非特異性結(jié)合所導(dǎo)致。因此，Protein A親和層析工藝在開發(fā)過程中需要適當(dāng)考慮對(duì)病毒的去除效果并進(jìn)行優(yōu)化，比如可以在淋洗緩沖液中加入去污劑，高鹽溶液等。
表6. ProteinA親和層析病毒去除研究結(jié)果（舉例）
總結(jié)
本文著重介紹了親和層析工藝開發(fā)過程中需要重點(diǎn)關(guān)注的部分工藝參數(shù)，除此之外，在實(shí)際執(zhí)行親和層析工藝開發(fā)時(shí)，如柱高、紫外峰收集范圍等工藝參數(shù)也需要綜合考慮，只是此類參數(shù)在開發(fā)過程中可依據(jù)公司平臺(tái)制定，通常無需專門設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究。另外需要注意的是，在親和層析的淋洗及洗脫開發(fā)階段，如果按照上述常規(guī)方法開發(fā)時(shí)出現(xiàn)淋洗效果不佳、洗脫過程中出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象或洗脫收集樣品聚體含量較高等情況，則可以考慮在相應(yīng)的緩沖液中加入一些金屬鹽、氨基酸或去污劑等添加劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，常用的添加劑包括氯化鈣、氯化鎂、精氨酸和吐溫20等。
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